زیست‌شناسی و فعالیت آنزیم‌های گوارشی پروتئاز و آمیلاز سوسک چهارلکه‌ای حبوبات Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Chrysomelidae) روی ارقام مختلف ماش

مقدمه

حبوبات دومین منبع مهم غذایی بشر بعد از غلات بوده و سرشار از پروتئین، کربوهیدرات، کلسیم و آهن می­باشند (Sanon et al., 2010). در بین حبوبات، ماشVigna radiata L. (Wilczek) به عنوان پروتئین گیاهی ارزان برای تغذیه انسان، جانوران اهلی و همچنین استفاده به صورت کود سبز از اهمیت خاصی برخوردار است (FAO, 2016).

سوسک چهارلکه‌ای حبوبات Callosobruchus maculatus (F.) (Coleoptera: Chrysomelidae) یکی ازاصلی­ترین عوامل خسارت­زا روی دانه­ی انواع حبوبات در شرایط مزرعه و انبار است. این سوسک بومی آفریقا بوده ولی امروزه در تمام نواحی گرمسیری و نیمه‌گرمسیری دنیا انتشار یافته و خسارت قابل توجهی به دانه­ی حبوبات در مزارع، انبارها و سیلوها وارد می‌‌نماید (Kumar, 2017). پراکنش وسیع و توانایی تغذیه­ای بالای سوسک چهارلکه‌ای حبوبات در مزرعه و انبار باعث کاهش ارزش اقتصادی حبوبات حساس به این آفت شده است (Johnson & Valer, 2003). در انبار، حشرات ماده تخم‌های خود را روی سطح دانه حبوبات قرار می­دهند. لاروها پس از تفریخ از تخم و عبور از پوسته دانه، وارد کوتیلدون شده و از محتویات آن تغذیه می‌کنند. در مواردی دانه­های آفت­زده در اثر تغذیه لارو کاملا خالی می‌شوند که موجب کاهش شدید وزن، ارزش غذایی و قدرت جوانه‌زنی آن شده و در نتیجه، ارزش بازارپسندی محصول به شدت کم می‌شود (Kumar, 2017). سوسک­های حبوبات علاوه بر خسارت­های زیاد به دانه­های انباری، به علت همراه داشتن بعضی از میکروارگانیسم­های بیماری­زا قادرند سلامتی انسان را در معرض خطر قرار دهند (Mohandass et al., 2006).

با عنایت به اینکه سوسک چهار لکه­ای حبوبات داخل دانه و در مکان‌های دور از دسترس فعالیت می‌کند، کنترل آن با چالش­های زیادی روبرو است. از جمله روش­های متداول کنترل این آفت، استفاده از آفتکش­های شیمیایی مانند متیل برماید و فستوکسین می­باشد که زیان جبران­ناپذیری بر انسان، جانداران غیرهدف و محیط زیست وارد کرده است Krzyżowski et al., 2021)). با توجه به خسارت بالای آفات انباری و مضرات کاربرد آفتکش­های شیمیایی، استفاده از ارقام مقاوم یکی از بهترین روش‌های کنترل یا کاهش خسارت این آفت محسوب می‌شود. مقاومت گیاه میزبان از ابزارهای مهم مدیریت تلفیقی آفات است که از لحاظ اقتصادی و امنیت محیط زیست، نتایج قابل قبولی را به دنبال داشته است (Kennedi et al., 1987). با توجه به اینکه پارامترهای زیستی و توانایی افزایش جمعیت یک حشره تحت تاًثیر تغذیه ازارقام گیاهی مختلف قرار می­گیرد، لذا می­توان با اندازه­گیری این پارامترهای آفت، از آن‌ها برای ارزیابی مقاومت و حساسیت ارقام به حشرات آفت استفاده کرد. یکی دیگر از روش‌های موثر در برنامه­های مدیریت آفات، استفاده از گیاهان تراریخته دارای ترکیبات شیمیایی ثانوی موثر روی آنزیم‌های گوارشی حشرات است. بازدارنده‌های آنزیم‌های گوارشی یکی از ترکیبات شیمیایی دفاعی موجود در گیاهان است که با مهار هضم درشت مولکول­هایی نظیر پروتئین­ها و کربوهیدرات­های وارد شده به دستگاه گوارش حشره، باعث کاهش تغذیه، کندی سرعت رشد و حتی مرگ به علت گرسنگی می‌شود (Azzouz et al., 2005). لذا به منظور استفاده موفقیت‌آمیز از بازدارنده‌های آنزیم‌های گوارشی در مدیریت آفات، بررسی میزان فعالیت پروتئازها و آمیلازهای گوارشی حشرات (به عوان دو گروه آنریم­های گوارشی غالب) و تاثیر آنها بر رشد، بقاء و تولیدمثل حشره ضروری است.

تاکنون هیچ پژوهشی درباره پارامترهای رشد جمعیت و فعالیت آنزیم­های گوارشی سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی ارقام ماش مورد آزمایش در پژوهش حاضر صورت نگرفته است. با این حال، مطالعاتی درباره تاثیر دانه حبوبات مختلف بر پارامتر­های زیستی و فیزیولوژی آنزیم­های گوارشی سوسک چهارنقطه­ای حبوبات انجام شده است که به برخی از آنها اشاره می­شود. یافته­های Roesli et al. (1990) نشان داد که تفاوت معنی­داری در زادآوری سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی دانه لوبیا چشم بلبلی و ماش وجود نداشت، اما طول دوره­ی نابالغ این آفت روی ماش کوتاه­تر بود. جدول زندگی سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی دانه­های لوبیا چشم بلبلی، نخود، عدس و ماش توسط Kazemi et al. (2009) بررسی و گزارش شد که لوبیا چشم بلبلی مطلوب‌ترین میزبان برای نشوونمای این آفت بود. زیست­شناسی C. maculatus روی دانه ماش توسط Devi & Devi (2014) بررسی و طول دوره­ی جنینی 6-7 روز، طول دوره­ی لاروی 18-22 روز و طول دوره­ی شفیرگی 4-5 روز گزارش شد. تاثیر تغذیه از دانه لوبیا چشم­بلبلی، نخود و ماش روی فعالیت پروتئاز گوارشی لاروهای سن چهارم سوسک چهارلکه­ای حبوبات بررسی و بالاترین فعایت ویژه سیستئین پروتئازها روی لوبیا چشم­بلبلی گزارش شد (Sarboland et al., 2017). زیست­شناسی و جدول زندگی C. maculatus روی دانه حبوبات مختلف بررسی و عدس به عنوان نامطلوب‌ترین میزبان برای افزایش جمعیت این سوسک معرفی شد (Bidar et al., 2021). مقاومت دانه­ی هفت رقم باقلا (مهتا، شادان، فیض، برکت، سرازیری، شاخ­بزی و اتونو) با بررسی ترجیح تخمگذاری و جدول زندگی سوسک چهارلکه­ای حبوبات ارزیابی و رقم­های شاخ­بزی و سرازیری به ترتیب حساس­ترین و مقاوم­ترین رقم­ها نسبت به این حشره معرفی شدند (Naseri et al., 2022). نتایج حاصل از مطالعه پارامترهای رشد جمعیت و فعالیت آنزیم­های گوارشی C. maculatusروی دانه6 رقم حبوبات مختلف نشان داد که لوبیا چشم­بلبلی، ماش و نخود آسیب­پذیری بیشتری نسبت به باقلا، عدس و بادام زمینی در برابر این آفت دارند (Mansouri et al., 2022). این پژوهش با هدف بررسی مقاومت و حساسیت پنج رقم تجاری ماش نسبت به C. maculatus با بررسی پارامترهای زیستی و فعالیت آنزیم­های گوارشی پروتئاز و آمیلاز آفت انجام شد تا با استفاده از ویژگی‌های مقاومت این ارقام و انتقال آن به ارقام حساس، بتوان کاربرد روش­های شیمیایی کنترل آفت را به حداقل رساند.

مواد و روش­ها

تهیه ارقام ماش. به منظور پرورش C. maculatus و انجام آزمایش­ها، دانه ارقام مختلف ماش شامل سخاوت، زربخش و پرتو از مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی صفی آباد (دزفول، خوزستان) و دو رقم وارداتی ازبک و افغان (به ترتیب واردشده از کشور ازبکستان و افغانستان) از بازار تهران تهیه شدند. ارقام ماش مورد آزمایش، جزو ارقام تجاری و رایج کشت شده در ایران می­باشند.

تعیین برخی ویژگی­های فیزیکی و شیمیایی دانه ارقام ماش

اندازه­گیری درصد رطوبت و سختی دانه. برای تعیین درصد رطوبت رقم­های مختلف ماش (در سه تکرار)، بر اساس روش تایید شده انجمنAACC (Approved methods of the American association of cereal chemists), (2000)، ابتدا 2 گرم از دانه­های آسیاب­شده هر رقم در دمای 130 درجه سلسیوس به مدت 3 ساعت خشک شد. سپس اختلاف بین وزن اولیه دانه­ها و وزن خشک آنها، تقسیم بر وزن اولیه به عنوان درصد رطوبت دانه در نظر گرفته شد. برای اندازه­گیری سختی دانه، از دستگاه سختی­سنج (مدل SANTAM  ساخت ایران) استفاده شد. به این صورت که سرعت حرکت صفحه بالایی (متحرک) دستگاه روی عدد 5 میلی­متر بر دقیقه تنظیم شد و میزان نیروی مورد نیاز (بر حسب نیوتون) برای شکستن هر دانه به عنوان شاخص سختی دانه در نظر گرفته شد. این آزمایش در 10 تکرار (هر تکرار شامل یک عدد دانه)انجام شد.

تعیین اندازه و وزن هزاردانه. اندازه (مساحت و حجم) دانه­ی هر یک از ارقام مورد آزمایش (در 10 تکرار) بر اساس فرمول­های ارائه شده توسط Mitchel (1990)  به شرح زیر محاسبه شدند:

D_g= (L ×W ×T)^1/3

S= π × D_g²

V = D^g3 × (π/6)

در فرمول بالا، D_g، S و V به ترتیب میانگین قطر ژئومتریک، مساحت و حجم دانه و L، W و T به ترتیب طول، عرض و ضخامت دانه می­باشدکه با استفاده از کولیس دیجیتالی (با دقت 01/0 میلی­متر) اندازه­گیری شد. میانگین وزن هزاردانه، با انتخاب تصادفی هزار عدد دانه ماش از هر رقم (در 10 تکرار) و وزن­گیری آنها با ترازوی دیجیتالی (با دقت 001/0 گرم) اندازه­گیری شد.

سنجش غلظت پروتئین و نشاسته‌. به منظور سنجش غلظت پروتئین محلول در ارقام مختلف ماش (در سه تکرار)، نخست دانه های هر رقم با دستگاه آسیاب­کن به طور کامل آرد شده و 05/0 ‌گرم از آرد هر رقم، همراه با 1 میلی‌لیتر تریس 100 میلی­مولار (اسیدیته 2/8) همگن شد. بعد از 10 دقیقه سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سلسیوس، فاز رویی (رونشین) برداشته شد. سپس 10 میکرولیتر از مواد همگن شده به 1 میلی‌لیتر از معرف برادفورد اضافه و پس از گذشت 30 دقیقه، جذب آن‌ها در طول موج 595 نانومتر تعیین شد (Bradford, 1976).

به منظور سنجش غلظت نشاسته (در سه تکرار)، 5/0 ‌گرم از آرد هر رقم با 5 میلی‌لیتر اتانول 80 درصد (با دمای 60 درجه سلسیوس) مخلوط شد. سپس به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شده و فاز رویی برداشته شد. باقی­مانده مخلوط داخل لوله آزمایش ریخته و به هر لوله 5 میلی­لیتر آب مقطر و 5/6 میلی­لیتر اسید پرکلریک 52 درصد اضافه شد. لوله­ها به مدت 20 دقیقه در دمای صفر درجه سلسیوس قرار داده شده، سپس سانتریفیوژ شده و فاز رویی جدا شد. با استفاده از سمپلر، 200 میکرولیتر از فاز رویی برداشته و با آب مقطر به حجم 1 میلی­لیتر رسانده شد. برای تهیه معرف آنترون، 200 میلی­گرم آنترون در 200 میلی­لیتر اسید سولفوریک 98 درصد حل شد، سپس 4 میلی­لیتر ار محلول آنترون به نمونه­ها اضافه شد. نمونه­ها به مدت 8 دقیقه در حمام آبی (با دمای 60 درجه سلسیوس) قرار داده و بلافاصله به داخل یخچال منتقل شدند. در نهایت جذب نمونه­ها بعد از گذشت 30 دقیقه، در طول موج 630 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر خوانده شد (Sheligl, 1986).

تهیه عصاره دانه ماش. برای عصاره­گیری از دانه­های هر رقم ماش، ابتدا مقدار 1 گرم از دانه­های آسیاب شده از هر رقم در 50 میلی­لیتر متانول 80 درصد به مدت 48 ساعت در دمای اتاق خیسانده شد. سپس از کاغذ صافی واتمن شماره 4 عبور داده شدند. متانول در دمای کمتر از 50 درجه سلسیوس توسط دستگاه روتاری تبخیر شد و باقی­مانده عصاره در دمای 4 درجه سلسیوس برای انجام آزمایشات نگهداری شد (Pourmorad et al., 2006).

اندازه­گیری میزان فنول و فلاونوئید. برای اندازه‌گیری میزان فنل کل (در سه تکرار)، به 100 میکرولیتر از عصاره دانه، 2 میلی‌لیتر کربنات سدیم (2 درصد)، 8/2 میلی‌لیتر آب مقطر و 100 میکرو لیتر معرف Folin-Ciocalteu (50 درصد) اضافه شد. بعد از گذشت نیم ساعت، جذب آن‌ها در دستگاه اسپکتروفتومتر با طول‌موج 720 نانومتر ثبت شد. اسید گالیک به‌عنوان استاندارد برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد. میزان فنل کل عصاره‌ها براساس میلی‌گرم معادل اسیدگالیک بر گرم وزن خشک دانه ثبت شد (Meda et al., 2005).

برای سنجش فلاونوئید دانه (در سه تکرار) به 500 میکرو لیتر از هر عصاره دانه، 5/1 میلی‌لیتر متانول (80 درصد)، 100 میکرولیتر محلول آلومینیوم کلراید (10 درصد)، 100 میکرو لیتر محلول استات سدیم 1 مولار و 8/2 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شد. جذب محلول بعد از گذشت 40 دقیقه در دستگاه اسپکتروفتومتر با طول‌موج 415 نانومتر نسبت به بلانک اندازه‌گیری شد. بلانک حاوی تمام ترکیبات ذکرشده در بالا بود اما بجای عصاره دانه، همان حجم متانول 80 درصد به بلانک اضافه شد. برای رسم منحنی استاندارد از کوئرستین استفاده شد. میزان فلاونوئید کل عصاره‌ها براساس میلی‌گرم معادل کوئرستین برگرم وزن خشک دانه گزارش شد (Mita et al., 1997).

پرورش سوسک چهارلکه­ای حبوبات. کلنی اولیه‌ی C. maculatus، از جمعیت آزمایشگاهی پرورش­یافته روی دانه­ی لوبیا چشم بلبلی (رقم مشهد) واقع در آزمایشگاه گروه گیاه‌پزشکی دانشگاه محقق اردبیلی تهیه و در ظروف پلاستیکی گرد (قطر 5/18 و ارتفاع 7 سانتی­متر) به طور گروهی پرورش داده شدند. این ظروف در دمای 1±28 درجه­ی سلسیوس، رطوبت نسبی 5±65 درصد و تاریکی کامل نگهداری شدند. حشرات کامل نر و ماده پس از ظهور، جمع­آوری و به طور مجزا به ظروف جدید (قطر 5/18 و ارتفاع 7 سانتی­متر) حاوی 150 گرم دانه هر یک از ارقام ماش انتقال داده شدند. پس از گذشت 24 ساعت، از تخم­های حداکثر یک­روزه برای انجام آزمایش­ها استفاده شد.

بررسی زیست­شناسی سوسک چهارلکه‌ای حبوبات روی ارقام مختلف ماش. برای بررسی تأثیر تغذیه از ارقام مختلف ماش روی زیست­شناسی آفت، 30 جفت از افراد بالغ نر و ماده­ی سوسک چهارلکه‌ای حبوبات به طور مجزا داخل ظروف پرورش (قطر 5/18 و ارتفاع 7 سانتی­متر) حاوی دانه ارقام مختلف ماش قرار داده شدند. پس از 24 ساعت، تعداد 50 عدد تخم به ازای هر رقم انتخاب (هر دانه حاوی یک تخم) و به صورت انفرادی به ظروف پتری 6 سانتی­متری منتقل شدند. درب ظروف پتری برای تامین تهویه به ابعاد تقریبی یک سانتی­متر سوراخ و با توری مسدود شد. بازدید روزانه از ظروف انجام و طول دوره‌ی نشوونما و بقای مراحل نابالغ ثبت شد. پس از ظهور حشرات کامل، هر یک جفت حشره نر و ماده، برای جفتگیری و تخمگذاری به ظروف پتری 6 سانتی‌متری حاوی 5 عدد دانه ارقام مورد آزمایش (به عنوان بستر تخمگذاری) منتقل شدند. طول عمر حشرات کامل نر و ماده و میزان زادآوری (تعداد تخم­های گذاشته شده) در هر روز و در طول دوره تخمگذاری تا پایان عمر حشرات کامل به طور دقیق مورد بررسی قرار گرفت.

پارامترهای رشد جمعیت سوسک چهارلکه‌ای حبوبات روی ارقام ماش. جدول زندگی (پارامترهای رشد جمعیت) سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی پنج رقم مختلف ماش به روش دوجنسی سن-مرحله رشدی بررسی شد. بدین منظور، ابتدا نرخ بقای ویژه سنی (l_x) و زادآوری ویژه‏ سنی (m_x) آفت با استفاده از معادله‏های زیر محاسبه شدند (Chi and Su, 2006):

l_x

m_x=

سپس پارامترهای رشد جمعیت شامل نرخ ناخالص تولید مثل (GRR)، نرخ خالص تولید مثل (R₀) تولید مثل، نرخ ذاتی افزایش جمعیت (r)، نرخ متناهی افزایش جمعیت (λ) و متوسط زمان یک نسل (T) آفت با استفاده از معادله­های زیر محاسبه شدند (Chi & Su, 2006):

λ = e^r

سنجش محتوای پروتئین و فعالیت آنزیم‌های گوارشی لارو

تهیه عصاره آنزیمی. برای تهیه­ی عصاره­ی آنزیمی، 50 عدد لارو سن چهارم (آخر) C. maculatusپرورش­یافته روی هر رقم ماش انتخاب و کل بدن لارو در یک میلی­لیتر آب مقطر با استفاده از هموژنایزر برقی با سرعت rpm× 3500 به مدت 30 ثانیه روی یخ همگن شدند. مخلوط‌های حاصل در دمای 4 درجه­ی سلسیوس با سرعت  (×g)15000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. رونشین­های به دست آمده جداسازی شد و به‌منظور سنجش میزان پروتئین بدن و فعالیت پروتئولیتیک و آمیلولتیک گوارشی مورد استفاده قرار گرفت (Borzoui & Bandani, 2013).

سنجش محتوای پروتئین بدن لارو. محتوای پروتئین بدن لاروهای سن آخر بر اساس روش Bradford (1976) اندازه­گیری شد. ابتدا 20 میکرولیتر از عصاره بدن لارو با 1 میلی­لیتر معرف بردفورد مخلوط شد. پس از گذشت 30 دقیقه، جذب نوری نمونه­ها در طول موج 595 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر اندازه­ گیری شد. این آزمایش در 3 تکرار انجام شد.

سنجش فعالیت آنزیم­های گوارشی. به منظور اندازه­گیری فعالیت آلفا-آمیلاز، ابتدا مقدار200 میکرولیتر بافر Tris-Hcl50 میلی مولار با اسیدیته‌ی 5/5، با 10 میکرولیتر عصاره‏ی آنزیمی حاصل از لاروها و 60 میکرولیتر نشاسته‏ی 1 درصد مخلوط شد. بعد از نیم ساعت واکنش در دمای 37 درجه‏ی سلسیوس، مقدار 200 میکرولیتر معرف رنگی3، 5- دی نیترو سالیسیلیک اسید به مخلوط واکنش اضافه شد. سپس در حمام آب گرم (میانگین دمای 90 درجه‏ی سلسیوس) به مدت 10 دقیقه قرار داده شد و پس از سرد شدن نمونه­ها، جذب نوری هر کدام در طول موج 540 نانومتر تعیین شد (Bernfeld, 1955). هر یک از آزمایشات مربوط به تیمار و شاهد در سه تکرار انجام شد. سوبسترای هموگلوبین (شرکت سیگما، آلمان) برای سنجش فعالیت پروتئازی کل لارو C. maculatus مورد استفاده قرار گرفت. مخلوط واکنش شامل 30 میکرولیتر محلول هموگلوبین 2 درصد در 90 میکرولیتر بافر استات سدیم (اسیدیته 5/5) (Cohen, 1993) و 15 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود که به مدت 120 دقیقه در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری شد. هضم پروتئینی با اضافه کردن 30 میکرولیتر تری کلرواستیک اسید 30 درصد متوقف و هموگلوبین هیدرولیز نشده موجود در واکنش، با قراردادن آنها در یخچال به مدت 30 دقیقه بطور کامل رسوب داده شد. بعد از 10 دقیقه سانتریفیوژ نمونه­ها با سرعت (g×)16000، حجم مساوی از معرف Folin-Ciocalteu رقیق شده به رونشین اضافه و پس از 10 دقیقه جذب آن در طول موج 650 نانومتر با استفاده از الایزاریدر تعیین شد(Folin and Ciocalteu, 1927). در شاهد (بلانک) عصاره آنزیمی بعد از اضافه کردن تری کلرواستیک اسید به مخلوط واکنش افزوده شد. هر یک از آزمایشات مربوط به تیمار و شاهد در سه تکرار انجام شد

تجزیه آماری. برای اطمینان از توزیع نرمال داده­ها، از آزمون Kolmogorov-Smirnov با استفاده از نرم­افزار آماریMinitab  نسخه 16 استفاده شد. تجزیه واریانس ویژگی­های فیزیکی و شیمیایی ارقام ماش، فعالیت آنزیمی و محتوای پروتئین بدن لاروها با استفاده از روش تجزیه واریانس یک­طرفه (one-way ANOVA) بانرم‌افزار آماریMinitab  نسخه 16 انجام شد. اختلاف­های آماری بین میانگین­ها نیز با استفاده از آزمون Tukey در سطح احتمال 5 درصد بررسی شد. نتایج به دست آمده از پارامترهای زیستی سوسک با روش دوجنسی سن-مرحله رشدی در نرم‌افزار TWOSEX-MS Chart تجزیه شدند (Chi, 1988; Chi, 2021). جهت تکراردار کردن این پارامترها از روش بوت‌استرپ و به منظور ارزیابی تفاوت آماری بین میانگین­ها، از آزمون بوت‌استرپ جفت­شده استفاده شد. ارتباط بین پارامترهای زیستی و فعالیت آنزیم­های گوارشی سوسک چهارنقطه­ای حبوبات با ویژگی­های فیزیکوشیمیایی دانه ارقام ماش با روش تجزیه همبستگی پیرسون بررسی شد.

نتایج

ویژگی­های فیزیکی و بیوشیمیایی ارقام ماش. نتایج حاصل از بررسی پارامترهای فیزیکی و بیوشیمیایی ارقام مختلف ماش در جدول 1 ارائه شده است. بیشترین درصد رطوبت دانه مربوط به رقم افغان و کمترین درصد مربوط به ارقام ازبک، سخاوت و زربخش بود (F_4,10= 12.29, P< 0.01). شاخص سختی پنج رقم ماش مورد بررسی دارای تفاوت معنی­دار بود (F_4,45= 40.23; P < 0.001)، به طوری که بیشترین شاخص سختی در رقم پرتو و کمترین شاخص در رقم زربخش مشاهده شد. بر اساس نتایج به دست آمده، مساحت (F_4,45= 48.32, P< 0.001) و حجم (F_4,45= 42.43, P< 0.001) دانه در ارقام سخاوت و زربخش بیشتر از رقم پرتو بود. بیشترین وزن هزار دانه در ارقام ازبک، سخاوت و زربخش و کمترین آن در رقم پرتو به دست آمد (F_4,45= 757.56,P < 0.001). بیشترین میزان پروتئین دانه در رقم پرتو و کمترین آن در رقم زربخش ثبت شد (F_4,10= 12.41, P< 0.01). با این حال، میزان نشاسته دانه در ارقام مختلف مورد آزمایش تفاوت معنی­داری نداشت (F_4,10= 2.31, P = 0.129). غلظت ترکیبات فنولی موجود در دانه در ارقام ازبک و زربخش بیشتر از سایر ارقام بود (F_4,10= 27.03, P < 0.001). بیشترین و کمترین محتوای فلاونوئید دانه به ترتیب در ارقام زربخش و افغان به دست آمد (F_4,10= 22.99, P < 0.001).

نرخ بقاء و زادآوری ویژه سنی سوسک چهارلکه‌ای حبوبات روی ارقام ماش. نرخ بقای ویژه سنی (l_x) و زادآوری ویژه سنی (m_x) سوسک C. maculatus روی دانه‌ ارقام ماش درشکل 1 نشان داده شده است. نرخ بقاء در اولین روز خروج حشره کامل ماده 74/0، 77/0، 86/0، 77/0 و 77/0 به ترتیب روی ارقام سخاوت، زربخش، پرتو، ازبک و افغان مشاهده شد. بیشترین سن حشرات ماده‌ روی تیمارهای ذکر شده به ترتیب در روزهای 33، 37، 33، 34 و 38 بود. شروع تخم‌گذاری ماده­ها روی تمامی ارقام ماش در سن 22 روز بود. بالاترین زادآوری ویژه سنی (m_x) روی ارقام مورد آزمایش به ترتیب 79/11، 69/9، 90/11، 59/8 و 36/10 نتاج در روز 25 بود.

زیست­شناسی و پارامترهای رشد جمعیت سوسک چهارلکه‌ای حبوبات روی ارقام ماش. درصد زنده­مانی، طول دوره نابالغ، طول عمر حشرات کامل و زادآوری سوسک چهارلکه­ای حبوباتروی ارقام مختلف ماش درجدول 2 آورده شده است. درصد زنده­مانی و طول دوره نابالغ حشره تفاوت معنی داری روی ارقام ماش مورد بررسی نداشت (P> 0.05). طول عمر حشرات کامل نر روی ارقام افغان و پرتو طولانی­تر از ارقام سخاوت و زربخش بود (P< 0.05). حشرات ماده پرورش­یافته روی رقم زربخش طولانی­ترین عمر و حشرات ماده پرورش­یافته روی رقم­های افغان و پرتو کوتاه­ترین عمر را داشتند (P< 0.05).طولانی­ترین دوره تخمگذاری آفت روی رقم زربخش و کوتاه­ترین آن روی رقم ازبک به دست آمد (P< 0.05). زادآوری سوسک­های ماده روی رقم پرتو به طور معنی­داری کمتر از سایر ارقام مورد بررسی بود (P< 0.05). تمامی پارامترهای جدول زندگی سوسک چهارلکه­ای حبوبات به جز نرخ ناخالص تولیدمثل (GRR)، اختلاف معنی­داری روی ارقام مختلف ماش نداشتند (P> 0.05، جدول 3). نرخ ناخالص تولیدمثل سوسک روی رقم زربخش به طور معنی­داری (P < 0.05) بیشتر از ارقام ازبک و پرتو بود.

محتوای پروتئین لارو و فعالیت آنزیم­های گوارشی سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی ارقام ماش. محتوای پروتئین بدن (F_4,10= 33.23, P < 0.001) و فعالیت آلفا-­آمیلاز(F_4,10= 153.15, P < 0.001)  و پروتئاز کل(F_4,10= 25.33, P < 0.001)  لاروهای سن چهارم سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی ارقام ماش مورد آزمایش، دارای اختلاف معنی­دار بودند. بیش­ترین میزان پروتئین در لاروهای پرورش­یافته روی رقم زربخش (421/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر) و کمترین مقدار در لاروهای تغذیه شده با رقم ازبک (373/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر) مشاهده شد. بیش­ترین فعالیت آنزیم آلفا-­آمیلاز روی رقم پرتو و کمترین فعالیت آنزیم روی رقم سخاوت ثبت شد. فعالیت پروتئولیتیک لاروهای پرورش­یافته با رقم سخاوت کمتر از لاروهای تغذیه شده با سایر ارقام بود (جدول 4).

تجزیه همبستگی بین پارامترهای سوسک چهارلکه­ای حبوبات و ویژگی­های فیزیکوشیمیایی ارقام ماش. نتایج تجزیه همبستگی پیرسون بین پارامترهای زیستی و فعالیت آنزیم­های گوارشی سوسک چهارلکه­ای حبوبات و ویژگی­های فیزیکوشیمیایی دانه ارقام ماش نشان داد که GRR حشره همبستگی منفی معنی­داری با شاخص سختی دانه ارقام ماش داشت. همچنین همبستگی مثبت معنی­داری بین درصد رطوبت دانه با طول عمر حشرات کامل نر، مساحت و حجم دانه با زادآوری و میزان فلاونوئید دانه با طول عمر حشرات کامل ماده مشاهده شد. بین سایر پارامترهای زیستی و فعالیت آنزیم‌های گوارشی مورد بررسی حشره با سایر ویژگی­های فیزیکوشیمیایی ارقام ماش مورد آزمایش همبستگی معنی­داری ثبت نشد (جدول 5).

جدول 1- میانگین (± خطای معیار) برخی ویژگی­های فیزیکی و بیوشیمیایی دانه ارقام مختلف ماش

Table 1. Mean (± SE) some physical and biochemical characteristics of the seed of different green gram cultivars

شکل 1-نرخ بقای ویژه­ی سنی (l_x) و زادآوری ویژه­ی سنی (m_x) Callosobruchus maculatus روی دانه ارقام مختلف ماش

Fig. 1. Age-specific survival rate (l_x) and age-specific fecundity (m_x) of Callosobruchus maculatus reared on seed of different green gram cultivars

جدول 2. زیست­شناسی (میانگین ± خطای معیار) سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی دانه ارقام مختلف ماش

Table 2. Life history (mean ± SE) of Callosobruchus maculatus on seed of different green gram cultivars

 جدول 3- پارامترهای رشد جمعیت (میانگین ± خطای معیار) سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی دانه ارقام مختلف ماش

Table 3. Population growth parameters (mean ± SE) of Callosobruchus maculatus on seed of different green gram cultivars

بحث و نتیجه گیری

یافته­ های پژوهش حاضر نشان داد که سوسک چهارلکه­ای حبوبات واکنش تغذیه­ای و زیستی متفاوتی نسبت به عوامل فیزیکی و بیوشیمیایی دانه ارقام ماش مورد آزمایش داشت. به طوری که برخی پارامترهای زیستی و فعالیت آنزیم­های گوارشی آفت به طور معنی­داری تحت تاثیر ارقام مورد تغذیه حشره قرار گرفت. تغذیه سوسک چهارلکه­ای حبوبات در مرحله لاروی از دانه ارقام ماش مورد آزمایش، اثر معنی­داری روی درصد زنده­مانی و طول دوره نابالغ نداشت. عدم تفاوت در بقاء و نشوونمای سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی این ارقام نشان می­دهد که لاروها توانایی تغذیه­ی بهینه از دانه ارقام ماش را دارا بوده و یا کیفیت غذایی دانه­ها برای نشوونمای مطلوب لاروها یکسان بوده است (Seram et al., 2016). به عبارت دیگر، تغییر در ویژگی­های فیزیکی و بیوشیمیایی دانه ارقام مورد آزمایش، اثر معنی­داری روی مراحل قبل از بلوغ آفت نداشت. محدوده طول دوره نابالغ سوسک چهارلکه­ای حبوبات در پژوهش حاضر، همراستا با مقادیر گزارش شده توسط Mansouri et al. (2022) وBidar et al. (2021) برای سوسک چهارلکه­ای حبوبات پرورش­یافته روی دانه ماش می­باشد. با این حال، طول دوره نابالغ آفت روی ارقام ماش کوتاه­تر از مقدار گزارش شده توسط  Naseriet al. (2022)برای سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی ارقام مختلف باقلا می­باشد. این تفاوت­ها ممکن است به دلیل تفاوت در گونه میزبان و ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی آنها باشد. با توجه به اینکه لاروهای سوسک چهارلکه­ای حبوبات در داخل دانه محصور بوده و تمامی مراحل لاروی و شفیرگی را درون یک دانه سپری می­کنند، لذا تخم­گذاری سوسکهای ماده روی دانه­های با ارزش غذایی بالاتر، برای زنده­مانی و نشوونمای بهتر لاروها و شفیره­ها اهمیت بسزایی دارد (Messina, 1991). حشره کامل سوسک چهارلکه­ای حبوبات قادر به تغذیه نیستند، بنابراین توانایی تغذیه­ای و هضم و جذب غذا در دوره لاروی، تعیین­کننده طول عمر و قابلیت تولیدمثلی حشرات کامل خواهد بود. تغذیه سوسک چهارلکه­ای حبوبات در مرحله لاروی اثر معنی­دار روی طول عمر حشرات کامل نر و ماده داشت. در پژوهش حاضر، طولانی بودن عمر حشرات کامل ماده و دوره تخم­گذاری روی دانه رقم زربخش می­تواند به دلیل نرم­تر بودن دانه (شاخص سختی کمتر) این رقم در مقایسه با سایر ارقام مورد بررسی باشد. علاوه بر این، کوتاه بودن طول عمر حشرات کامل ماده روی رقم پرتو منجر به کاهش معنی­دار زادآوری (تعداد تخم­های گذاشنه شده) حشرات پرورش یافته روی این رقم شد. در این آزمایش، اندازه و وزن دانه در رقم پرتو کمتر از رقم زربخش بود، بنابراین، سوسک­های ماده تخم­های کمتری روی رقم پرتو در مقایسه با سایر ارقام قرار دادند. این یافته همسو با نتایج بررسی­های سایر پژوهشگران می­باشد که اعلام کردند سوسک چهارلکه­ای حبوبات، روی دانه حبوبات بزرگ­تر و سنگین­تر در مقایسه با دانه­های کوچکتر و سبکتر، تخم­های بیشتری قرار می­دهد (Patil & Jadhav, 1985; Mbata, 1993; Bidar et al., 2021).

خصوصیات فیزیکی و مرفولوژیکی دانه حبوبات شامل اندازه، شکل، نرمی بافت، زبری و ضخامت پوسته بذر روی میزان تخمگذاری سوسک چهارلکه­ای حبوبات تاثیر قابل توجهی دارند (Southgate, 1979; Sarikarin et al., 1999). در این آزمایش، علی رغم بالا بودن غلظت پروتئین دانه در رقم پرتو، به دلیل سختی بالای دانه این رقم لاروها قادر به تغذیه بهینه نبوده و حشرات ماده حاصل از آنها کوتاه­ترین عمر و زادآوری را داشتند. همبستگی مثبت و معنی­دار بین زادآوری سوسک چهارلکه­ای حبوبات و اندازه (مساحت و حجم) دانه ارقام ماش نشان داد که اندازه دانه یکی از عوامل اصلی تاثیرگذار روی تعداد تخم­های گذاشته شده توسط حشره می­باشد. دلیل احتمالی دیگر، وجود ترکیبات دفاعی ناشناخته در پوسته دانه رقم پرتو می­باشد که ممکن است از تخمگذاری سوسک­های ماده ممانعت کنند. به منظور اثبات این موضوع، انجام مطالعاتی در آینده برای شناسایی دیگر عوامل دفاعی موثر در مقاومت ارقام ماش نسبت به C. maculatusضروری است. با توجه به همبستگی مثبت و معنی­دار بین درصد رطوبت دانه و طول عمر حشرات کامل نر می­توان نتیجه گرفت که لاروهایی که به حشره نر تبدیل شدند از دانه­های با رطوبت بالاتر تغذیه بهتری در مقایسه با دانه­های با رطوبت پایین­تر داشتند. علی رغم طولانی بودن عمر حشرات کامل نر روی رقم پرتو، اما به دلیل کاهش معنی­دار عمر حشرات کامل ماده روی این رقم، زادآوری آفت روی این رقم کاهش یافت. محدوده زادآوری سوسک چهارلکه­ای حبوبات در پژوهش حاضر، نزدیک به مقادیر گزارش شده توسط Mansouri et al. (2022) و Bidar et al. (2021) برای سوسک چهارلکه­ای حبوبات پرورش­یافته روی دانه ماش می­باشد. در این پژوهش، اغلب پارامترهای رشد جمعیت سوسک چهارلکه­ای حبوبات تفاوت معنی­داری روی ارقام ماش مورد بررسی نداشتند. با این حال، مقدار GRR حشره روی رقم زربخش بیشتر از ارقام ازبک و پرتو به دست آمد. یکی از عوامل کلیدی تاثیرگذاز روی GRR آفت، سختی دانه ارقام ماش می­باشد زیرا بر اساس نتایج همبستگی، با افزایش شاخص سختی دانه، مقدار GRRسوسک کاهش یافت. علی رغم بالا بودن میزان فنل و فلاونوئید در رقم زربخش، افزایش مقدار GRRروی این رقم نشانگر توانایی بالای لاروها در خنثی کردن ترکیبات دفاعی میزبان برای استفاده هر چه بهتر از عناصر غذایی آن می­باشد. همچنین، این احتمال وجود دارد که غلظت فنل و فلاونوئید در رقم زربخش به اندازه­ای نبوده که برای لاروهای حشره سمی یا بازدارنده باشد.

جدول 4-میانگین (± خطای معیار) محتوای پروتئین و فعالیت گوارشی پروتئاز و آمیلاز لاروهای سن چهارم سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی دانه ارقام مختلف ماش

Table 4. Mean (± SE) protein content, and digestive proteolytic and amylolytic activity of fourth-instar larvae of Callosobruchus maculatus on seed of different green gram cultivars

جدول 5- ضرایب همبستگی پیرسون (r) بین پارامترهای زیستی و فعالیت آنزیم­های گوارشی سوسک چهارنقطه­ای حبوبات با ویژگی­های فیزیکی و شیمیایی ارقام ماش مورد آزمایش

Table 5. Correlation coefficients (r) between biological parameters and digestive enzymes activity of Callosobruchus maculatus with physical and biochemical traits of tested green gram cultivars

طبق نتایج به دست آمده، با توجه به اینکه نرخ ذاتی افزایش جمعیت (r) سوسک چهارلکه­ای حبوبات، به عنوان اصلی­ترین پارامتر رشد جمعیت حشره، تفاوت معنی­داری روی ارقام ماش مورد آزمایش نداشت، بنابراین حشره توانایی یکسانی برای افزایش جمعیت روی این ارقام داشته است. مقادیر نرخ ذاتی افزایش جمعیت سوسک چهارلکه­ای حبوبات در پژوهش حاضر، نزدیک به مقادیر گزارش شده توسط Mansouri et al. (2022) و Bidar et al. (2021) برای سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی دانه ماش می­باشد. با این حال، مقادیر نرخ ذاتی افزایش جمعیت و نرخ خالص تولیدمثل این حشره روی ارقام ماش بیشتر از مقادیر گزارش شده برای سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی ارقام مختلف باقلا است (Naseri et al., 2022) که نشان دهنده مطلوبیت بالاتر دانه ماش در مقایسه با دانه باقلا برای افزایش جمعیت سوسک چهارلکه­ای حبوبات می­باشد. این تفاوت­ها می­تواند به دلیل تفاوت در گونه میزبان و ویژگی‌های فیزیکی و بیوشیمیایی آنها باشد.

بر اساس یافته­های پژوهش حاضر، غلظت پروتئین دانه بین ارقام زربخش و ازبک تفاوت معنی­داری نداشت، با این حال میزان پروتئین بدن لاروهای تغذیه شده با رقم زربخش بیشتر از لاروهای پرورش­یافته با رقم ازبک بود. این امر می­تواند به دلیل سختی کمتر رقم زربخش در مقایسه با رقم ازبک باشد که منجر به تغذیه بهتر لاروها و هضم و جذب بیشتر پروتئین در بدن لاروها شده است. نتایج این پژوهش نشان داد که لاروهای سن چهارم سوسک چهارلکه­ای حبوبات توانایی بالایی در تنظیم ترشح آنزیم­های گوارشی پروتئاز و آمیلاز در واکنش به تغذیه از ارقام مختلف ماش داشتند. کمترین فعالیت آنزیم­های گوارشی پروتئاز و آمیلاز روی رقم سخاوت بود. میزان فعالیت آمیلاز لاروهای تغذیه شده با رقم پرتو، تقریبا 5/1 برابر بیشتر از فعالیت آمیلاز لاروهای پرورش­یافته روی رقم سخاوت بود. با توجه به عدم تفاوت معنی­دار غلظت نشاسته در ارقام مختلف ماش، این ویژگی دانه تاثیری بر تغییر فعالیت آمیلاز حشره روی ارقام مورد آزمایش نداشت. با این حال، Lazar et al. (2014) گزارش کردند که دانه­های ارقامی از ماش که نشاسته بالاتری دارند برای تغذیه لاروهای سوسک چهارلکه­ای حبوبات مطلوب­تر از ارقامی هستند که نشاسته کمتری دارند. سطح بیان ژن آلفا-آمیلاز، مطابق با مقدار نشاسته یا گلوکز موجود در غذا تنظیم می‌شود. حشره با افزایش محتوی نشاسته و یا گلوکز موجود در غذا، میزان بیان آنزیم آلفا-آمیلاز و در نتیجه میزان ترشح آن را کاهش می‌دهد (Silva et al., 2001). البته ‌این مورد همیشه صادق نیست و در جایی که مقدار درشت‌مغذی‌ها در غذا متناسب با نیاز حشره بالا رود، حشره ممکن است فعالیت آنزیمی ‌را تا یک حد مورد نیاز بالا ببرد تا بیش‌ترین استخراج موادغذایی را داشته باشد و از آن برای نشوونمای بهتر استفاده کند (Kotkar et al., 2009). فعالیت پایین آنزیم پروتئاز روی رقم سخاوت می‌تواند به دلیل کیفیت پایین درشت‌مغذی‌ها، سختی دانه و یا وجود پروتئین‌های مهارکننده آنزیم پروتئاز دراین رقم باشد. با این حال، نتایج Sarboland et al. (2017) نشان داد که فعالیت پروتئازی بالا در لاروهای سوسک چهارلکه­ای حبوبات روی دانه لوبیا چشم­بلبلی به دلیل پروتئین بیشتر لوبیا چشم­بلبلی در مقایسه با دانه نخود و ماش می­باشد.

بر اساس یافته­های حاصل از پژوهش حاضر، ویژگی­های فیزیکی و بیوشیمیایی دانه ارقام مورد آزمایش، تاثیر معنی­داری روی محتوای پروتئین بدن و فعالیت آنزیم­های گوارشی آمیلاز و پروتئاز لاروهای سن چهارم داشت، به طوری که کمترین فعالیت آنزیم­های گوارشی آمیلاز و پروتئاز روی رقم سخاوت به دست آمد. با این حال، درصد زنده­مانی، طول دوره‏ی مراحل نابالغ و اغلب پارامترهای رشد جمعیت حشره روی رقم­های مختلف ماش تفاوت معنی­داری نداشت. بنابراین، تفاوتی در حساسیت و مقاومت رقم­های ماش مورد بررسی نسبت به سوسک چهارلکه­ای حبوبات مشاهده نشد. با توجه به حساسیت بالای تمامی ارقام مورد آزمایش در برابر سوسک چهارنقطه­ای حبوبات، در انبار­هایی که این آفت شیوع داشته و ارقام ماش در کنار یکدیگر انبار می­شوند، بایستی با پایش دقیق محصول، اقدامات مراقبتی بیشتری برای پیشگیری از طغیان آفت اتخاذ شود.

Author's Contributions

Bahram Naseri: conceptualization, investigation, final review and edit, visualization, supervision, project administration and funding acquisition. Aryan Ebadi: methodology, formal analysis, investigation, draft preparation, final review and edit. Zahra Rezaei: methodology, final review and edit.

 Author's Information

Funding

This research has received financial support by the University of Mohaghegh Ardabili, Ardabil, Iran.

Data Availability Statement

This research was supported by University of Mohaghegh Ardabili which is greatly appreciated.

 Acknowledgments

This research was supported by the University of Mohaghegh Ardabili (Research grant number: 1402.D.9.29071).

Ethics Approval

Insects and mites were used in this study. All applicable international, national, and institutional guidelines for the care and use of animals were followed. This article does not contain any studies with human participants performed by any of the authors.

 Conflict of Interest

The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this paper.

Generative AI statement

The authors declare that no Gen AI was used in the creation of this manuscript.

 REFERENCES

AACC, 2000. Approved methods of the American association of cereal chemists.10^th, American association of cereal chemists, Saint Paul, Minnesota.

Azzouz, H., A. Cherqui, E. D. M. Campan, Y. R. Duport, G. Jouanin, L. Kaiser & Giordanengo, p.  (2005) Effects of plant protease inhibitors oryzacystatin I and soybean Bowman–Birk inhibitor, on the aphid Macrosiphum euphorbiae (Homoptera: Aphididae) and its parasitoid Aphelinus abdominalis (Hymenoptera: Aphelinidae). Journal of Insect Physiology, 51: 75-86.. https://doi.org/10.1016/j.jinsphys.2004.11.010

Bernfeld, P. (1955) Amylase α and β. Methods in Enzymology, 1: 149-154. https://doi.org/10.1016/0076-6879(55)01021-5

Bidar, F., J. Razmjou, A. Golizadeh, S. A. A. Fathi, A. Ebadollahi & Naseri, B. (2021) Effect of different legume seeds on life table parameters of cowpea weevil, Callosobruchus maculatus (F.) (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Stored Products Research, 90: 101755. https://doi.org/10.1016/j.jspr.2020.101755

Borzoui, E., Bandani, A. R. (2013) Wheat and triticale proteinaceous seed extracts inhibit gut α-amylase and protease of the carob moth, Ectomyelois ceratoniae. Molecular Entomology, 4: 13–21. https://doi: 105376/me.2013.04.0003

Bradford, M. A. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-day binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-254. https://doi.org/10.1016/0003-2697(76)90527-3

Chi, H. (1988) Life-table analysis incorporating both sexes and variable development rates among individuals. Environmental Entomology, 17(1): 26-34. https://doi.org/10.1093/ee/17.1.26

Chi, H. (2021) TWOSEX–MSChart: a Computer Program for the Age Stage, Two-Sex Life Table Analysis. National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan. doi:10.1127/entomologia/2022/1851

Chi, H. & Su, H. Y. (2006) Age-stage, two-sex life tables of Aphidius gifuensis (Ashmead)(Hymenoptera: Braconidae) and its host Myzuspersicae (Sulzer)(Homoptera: Aphididae) with mathematical proof of the relationship between female fecundity and the net reproductive rate. Environmental Entomology, 35(1): 10-21. https://doi.org/10.1603/0046-225X-35.1.10

Cohen, A. C. (1993) Organization of digestion and preliminary characterization of salivary trypsin-like enzymes in a predaceous heteropteran, Zelus renardii. Journal of Insect Physiology, 39 (10): 823-829. https://doi.org/10.1016/0022-1910(93)90114-7

Devi, M. B. Su, Devi, N. V.  (2014) Biology and morphometric measurement of cowpeaweevil, Callosobruchus maculatus F. (Coleoptera: Bruchidae) in green gram. Journal of Entomology and Zoology Studies, 2 (3): 74-76.

FAO, (2016) Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy.

Folin, O. & Ciocalteu, V. (1927) On tyrosine and tryptophane determinations in proteins. Journal of Biological Chemistry, 73: 627-650. https://doi: 10.1016/S0021-9258(18)84277-6

Johnson, J. A. & Valero, K. A.  (2003) Use of commercial freezers to control cowpea weevil, Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae), in organic garbanzo beans. Journal of Stored Product Research, 96(6): 1952- 1957. https://doi.org/10.1603/0022-0493-96.6.1952

Kazemi, F., Talebi, A. A., Fathipour, Y.  & Farahani, S. (2009) A comparative study on the effect of four leguminous species on biological and population growth parameters of Callosobruchus maculatus (F.) (Col.: Bruchidae). Advances in Environmental Biology, 3(3): 226-232.

Kennedy, G. G., Gould, F., Deponti, O. M. B. & Stinner, R. E.  (1987) Ecological, agricultural and commercial considerations in the deployment of insect resistant King ABS (1994) Heliothis/Helicoverpa (Lepidoptera: Noctuidae). In: Mathews GA, Tunstall JP (eds) Insect Pests of Cotton, pp: 39-106. CAB International, U.K.

Kotkar, H. M., Sarate, P. J., Tamhane, V. A., Gupta, V.  S.  & Giri, A. P. (2009) Responses of midgut amylases of Helicoverpa armigera to feeding on various host plants. Journal of Insect Physiology, 55: 663-670. https://doi.org/10.1016/j.jinsphys.2009.05.004

Krzyżowski, M., Baran, B. & Francikowski, J. (2021) Intergenerational transmission of resistance of Callosobruchus maculatus to essential oil treatment. Molecules, 26(15): 4541. https://doi.org/10.3390/molecules26154541

Kumar, R. (2017) Insect Pests of Stored Grain: Biology, Behavior, and Management Strategies. https://doi.org/10.1201/9781315365695

Lazar, L., Panickar, B. & Patel, P. S. (2014) Impact of biochemicals on the developmental stages of pulse beetle, Callosobruchus maculatus infesting green gram. Journal of Food Legumes, 27(2): 121-125. https://doi.org/10.59797/jfl.v27i2.810

Mansouri, S. M., Naseri, B. & Bidar, F. (2022) Oviposition preference, population growth and digestive enzymatic function of Callosobruchus maculatus (F.) (Coleoptera: Chrysomelidae) on six legume grains. Journal of Stored Products Research, 99. https://doi.org/10.1016/j.jspr.2022.102011

Mbata, G. N. (1993) Evaluation of susceptibility of varieties of cowpea to Callosobruchus maculatus (F.) and Callosobruchus subinnotatus (Pic.) (Coleoptera: Bruchidae). Journal of Stored Products Research, 29:. https://doi.org/10.1016/0022-474X(93)90002-L

Meda, A., Lamien, C. E., Romito, M., Millogo, J. & Nacoulma, O. G. (2005) Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity. Food Chemistry, 91(3): 571-577. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2004.10.006

Messina, F. J. (1991) Life history variation in a seed beetle: adult egg-laying vs. larval competitive ability. Oecologia, 85: 447-455.

Mita, S., Murano, N., Akaike, M. & Nakamura, K. (1997) Mutants of Arabidopsis thaliana with pleiotropic effects on the expression of the gene for β‐amylase and on the accumulation of anthocyanin that are inducible by sugars. The Plant Journal, 11(4): 841-851. doi: 10.1046/j.1365-313x.1997.11040841.x

Mitchell, R. (1990) Behavioral ecology of Callosobruchus maculatus. pp. 317-330in Fujii, K., Gatehouse, A.M.R. Johnson, C.D. Mitchell, R. and Yoshida, T. (Eds.) Bruchids and Legumes: Economics, Ecology and Coeuolution. Kluwer, London.

Mohandass, S. M., Arthur, F. H., Zhu, K. Y. & Throne, J. E. (2006) Hydroprene: mode of action current status in stored-product pest management, insect resistance, and future prospects. Crop Protection, 25: 602-909. https://doi.org/10.1016/j.cropro.2006.01.014

Naseri, B., Hamzavi, F., Ebadollahi, A. & Sheikh, F. (2022) Physicochemical traits of Vicia faba L. seed cultivars affect oviposition preference and demographic parameters of Callosobruchus maculatus (F.) (Coleoptera: Chrysomelidae). Journal of Stored Products Research, 95. https://doi.org/10.1016/j.jspr.2021.101924.

Patil, S. M., Jadhav, I. D. (1985) Studies on the relative susceptibility of some promising varieties of pea, Pisum sativum to the pulse beetle, Callosobruchus maculatus in storage. Bulletin of Grain Technology, 20: 28.

Pourmorad, F., Hosseinimehr, S. J. & Shahabimajd, N. (2006) Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants. African Journal of Biotechnology, 5: 1142-1145. http://www.academicjournals.org/AJB

Roesli, R., Dobie, P. & Gerard, B. (1990) Strain differences in two species of Callosobruchus (Coleoptera: Bruchidae) developing on seeds of cowpea {Vigna unguiculata (L.)} and green gram {V. radiata (L.)}. Biotropia, 4: 19-30.

Sanon, A., Ba, N. M., Binso-Dabire, C. L. & Pittendrigh, B. R.  (2010) Effectiveness of spinosad (naturalytes) in controlling the cowpea storage pest, Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae). Journal of Economic Entomology, 103(1): 203-210. https://doi.org/10.1603/EC09093

Sarboland, S., Mehrkhou, F. & Imani, M (2017) Gut proteolytic profile of larval Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Chrysomelidae) in response to feeding on different fabaceous host plants. Journal of Agricultural Science and Technology, 19: 121-132.

Sarikarin, N., Srinives, P., Kaveeta, R. & Saksoong, P. (1999) Effect of seed texture layer on bruchid infestation in mungbeanVigna radiata (L.) Wilczek. Science Asia, 25: 203–206.. doi:10.2306/scienceasia1513-1874.1999.25.203

Seram, D., Mohan, S., Kennedy, J. S. & Senthil, N. (2016) Development and damage assessment of the storage beetle, Callosobruchus maculatus (Thanjavur and Coimbatore strain) under normal and controlled conditions . Pp. 25–31. In: Navarro S, Jayas DS, Alagusundaram K, (Eds.) Proceedings of the 10th International Conference on Controlled Atmosphere and Fumigation in Stored Products (CAF2016), CAF Permanent Committee Secretariat, Winnipeg, Canada.

Sheligl, H. Q. (1986) Die verwertungorgngischersourendurch chlorella lincht. Planta Journal, 47-51.

Silva, C. P., Terra, W. R., Xavier-Filho, J., Grossi de Sa, M. R., Isejima, E. M., DaMatta, A. R., Miguens, F. C. & Bifano, T. D. (2001) Digestion of legume starch granules by larvae of Zabrotes subfasciatus (Coleoptera: Bruchidae) and the induction of α–amylases in response to different diets. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 31: 41-50. https://doi.org/10.1016/S0965-1748(00)00103-X

Southgate, B. J. (1979) Biology of the Bruchidae. Annual Review of Entomology, 24: 449-473. https://doi.org/10.1146/annurev.en.24.010179.002313