بررسی امکان کنترل آفت برگ‌خوار سفید بلوط (Leucoma wiltshirei Coll. (Lep., Erebidae)) از طریق آغشته نمودن تنه درخت به قارچ‌های بیمارگر حشرات؛ یک مطالعه میدانی دو ساله

بررسی امکان کنترل آفت برگ‌خوار سفید بلوط Leucoma wiltshirei Coll. (Lep., Erebidae) از طریق آغشته نمودن تنه درخت به قارچ‌های بیمارگر حشرات؛ یک مطالعه میدانی دو ساله

سیده معصومه زمانی¹ ، مرضیه علی‌نژاد¹ ، حسن عسکری² ، ریحانه غلامی قوام‌آباد¹ ، نرگس سپاسی¹  ، سمیرا فراهانی¹  و یزدانفر آهنگران³

• موسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع کشور، تهران، ایران
• موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور، تهران، ایران
• سازمان جنگل‌ها، مراتع و آبخیزداری کشور، چالوس، مازندران، ایران

چکیده: شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط، Leucoma wiltshirei Collenette, 1938 (Lepidoptera: Erebidae)، یکی از آفات مهم درختان بلوط ایرانی (Quercus brantii Lindl.) در جنگل‌های زاگرس است که خسارت بسیاری به این درختان وارد می‌کند. توسعه برنامه‌های مدیریت تلفیقی آفات با استفاده از عوامل کنترل بیولوژیک به‌ویژه قارچ‌های بیمارگر حشرات، می‌تواند راهبردی مؤثر و کارآمدی برای کاهش مصرف حشره‌کش‌های شیمیایی در مدیریت آفات جنگل باشد. در پژوهش حاضر، 11 جدایه از قارچ بیمارگر حشرات Beauveria bassiana، بومی جنوب غربی ایران از لاروهای شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط جدا شد. در آزمون‌های آزمایشگاهی، جدایه BG4 در غلظت 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر و 48 ساعت پس از تیمار، بیشترین میزان مرگ‌ومیر را در لاروها (3/33 درصد) ایجاد کرد. بیماری‌زایی این جدایه به همراه سه جدایه قارچی دیگر، شامل B. bassiana B2، Metarhizium anisopliae M1 وLecanicillium lecanii Vertalec^®  روی لاروهای سن دوم شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط ارزیابی شد. مقادیر میانه غلظت کشنده (LC₅₀) جدایه‌های B2، BG4، M1 و Vertalec^® 96 ساعت پس از تیمار روی لاروهای سن دوم به ترتیب 10⁵×1/2، 10⁷×2/1، 10⁹×5 و 10¹³×9/1 کنیدیوم در میلی‌لیتر، محاسبه گردید. در شرایط صحرایی در دو سال متوالی (1402 و 1403)، محلول‌پاشی تنه درختان با فرمولاسیون‌های جدایه‌های B2 و BG4 حاوی سورفکتانت غیریونی و پارافین به ترتیب منجر به مرگ‌ومیر 75-73 و 62-61 درصد جمعیت لاروهای سن دوم و سوم آفت در منطقه رستم (استان فارس)، 30 روز پس از تیمار شد. نرخ بالای مرگ‌ومیر لاروها پس از تیمار با جدایه‌های بومی B2 و BG4 از گونه B. bassiana در جنگل‌های زاگرس، نشان‌دهنده پتانسیل بالای این قارچ و کارایی محلول‌پاشی تنه درختان در کنترل بیولوژیک این آفت است. پژوهش‌های آینده می‌تواند بر پایداری فرمولاسیون‌های قارچی و بررسی اثر آن‌ها بر دشمنان طبیعی تمرکز داشته باشد.

کلمات کلیدی: بلوط ایرانی، بیماری شناسی حشرات، کنترل میکروبی، عوامل کنترل بیولوژیک، جنگل‌های زاگرس، فرمولاسیون‌های قارچی

مقدمه

گونه‌های بلوط (Quercus spp.) از اجزای مهم بسیاری از اکوسیستم‌های جنگلی معتدل و مدیترانه‌ای هستند و زیستگاه‌های مناسبی برای طیف گسترده‌ای از موجودات فراهم می‌کنند (Lindbladh & Foster, 2010; Bugalho et al., 2011). بلوط ایرانی Quercus brantii Lindl. از خانواده Fagaceae، یکی از گونه‌های گیاهی مهم جنگل‌های زاگرس است که بیشترین سطح از این رویشگاه را تحت تصرف خود داشته و در ارتفاعات مختلف آن یافت می‌شود (Ghazanfari et al., 2004). شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط، Leucoma wiltshirei Collenette, (Lep.: Erebidae) یکی از آفات مهم و کلیدی درخت بلوط ایرانی (Q. brantii) در ایران (Moradi et al., 2021; Rajaei et al., 2023)، عراق و ترکیه (Kemal et al., 2013) است. لاروهای شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط در طول فصل رشد، از برگ‌های درختان بلوط تغذیه و آسیب زیادی به گیاه میزبان وارد می‌کنند. در سال‌های اخیر، طغیان گسترده‌ی این آفت با خسارت جبران‌ناپذیر در نواحی جنگلی زاگرس جنوبی ایران همراه بوده است. درختان بلوط، مورد حمله‌ی لاروهای زمستان گذران و نسل اول و دوم آفت قرار می‌گیرند و پس از ریزش برگ‌ها، جوانه‌های درخت دوباره شروع به فعالیت می‌نمایند، اما درخت آلوده ضمن تجدید حیات، مجدد مورد هجوم قرار می‌گیرد. هجوم برگ‌خوار سفید بلوط 2 تا 3 بار تکرار می‌گردد و در اثر این بی‌برگی اعمال فیزیولوژیکی درخت دچار مشکل شده و آفات درجه دوم، به ویژه پوست‌خواران به این درختان حمله کرده و در نهایت درخت از پا در می‌آید (Abai, 1980).

این آفت زمستان را به‌صورت لارو سن دوم یا سوم زیر پوستک‌های درختان آلوده سپری می‌کند. لاروها در اواخر اسفند و اوایل فروردین از پناهگاه‌های زمستانی خارج شده و پس از پنج سن لاروی، به مرحله پیش‌شفیرگی و سپس شفیرگی می‌رسند. دوره شفیرگی حدود ۱۰ روز است و خروج پروانه‌ها به‌صورت گروهی رخ می‌دهد. ماده‌ها ۲۴ ساعت پس از خروج از شفیره جفت‌گیری کرده و تخم‌گذاری را آغاز می‌کنند. تخم‌ها به طور معمول به‌صورت رشته‌ای شامل ۶ تا ۱۲ و گاهی تا ۱۸ عدد روی برگ‌ها یا شاخه‌های جوان قرار می‌گیرند و هر ماده در طول ۵ تا ۷ روز عمر خود حدود ۱۰۰ تا ۱۳۰ تخم می‌گذارد که پس از یک هفته تفریخ می‌شوند. این آفت در استان فارس سه نسل دارد و لاروهای سن دوم یا سوم از اوایل آذر وارد دیاپوز می‌شوند. تغذیه مجدد از اواخر اسفند آغاز و ظهور پروانه‌ها از اواخر اردیبهشت تا اواسط خرداد ادامه دارد (Abai & Askari, 2015).

استفاده از سموم آفت‌کش طی دهه‌های گذشته به‌عنوان یکی از روش‌های متداول کنترل آفات در بخش‌های کشاورزی و جنگلی مطرح بوده است. با وجود اثربخشی سریع این ترکیبات، کاربرد بی‌رویه‌ی آن‌ها موجب بروز مشکلات متعددی از جمله برهم خوردن تعادل زیست‌محیطی، ایجاد مقاومت در جمعیت آفات، تهدید سلامت انسان و موجودات غیرهدف شده است (Pimentel, 2005; Damalas & Eleftherohorinos, 2011; Isman, 2019). این چالش‌ها ضرورت استفاده از رویکردهای جایگزین و پایدارتر را در مدیریت آفات برجسته می‌سازد. در همین راستا، مدیریت تلفیقی آفات (Integrated Pest Management – IPM)، با تلفیق روش‌های مختلف کنترل آفات (شیمیایی، مکانیکی، زراعی و زیستی)، به‌عنوان یک راهبرد پایدار معرفی شده است که هدف آن کاهش وابستگی به سموم و به‌کارگیری ترکیبی از روش‌های سازگار با محیط زیست است (Dara, 2019). در میان مؤلفه‌های مختلفIPM ، عوامل کنترل بیولوژیک نقش اساسی در تنظیم جمعیت آفات و بازگرداندن تعادل اکولوژیک اکوسیستم‌ها دارند(Altieri, 1994). در میان عوامل کنترل بیولوژیک، قارچ‌های بیمارگر حشرات از جمله عوامل مؤثر، مفید و کم‌ضرر در مدیریت جمعیت آفات به‌شمار می‌روند. این قارچ‌ها به‌دلیل توانایی در ایجاد بیماری و مرگ در گونه‌های خاصی از حشرات میزبان بدون اثر بر موجودات غیرهدف، قابلیت تولید انبوه و پایداری نسبی در شرایط طبیعی، از اهمیت ویژه‌ای برخوردارند (Faria & Wraight, 2007; Butt et al., 2001). از دیگر ویژگی‌های مثبت آن‌ها می‌توان به ایمن بودن برای مهره‌داران و گیاهان، سازگاری با آفت‌کش‌های شیمیایی و امکان استفاده ترکیبی با عوامل کنترل بیولوژیک تجاری مانند Bacillus thuringiensis (Bt) اشاره کرد (Zimmermann, 2007; Inglis et al., 2001).

اگرچه در ایران و سایر کشورها مطالعات متعددی در زمینه‌ی شناسایی و ارزیابی کارایی قارچ‌های بیمارگر حشرات انجام شده است، اما بیشتر این پژوهش‌ها در مرحله‌ی آزمایشگاهی باقی مانده و هنوز در مقیاس میدانی یا تجاری به‌کار گرفته نشده‌اند. با این حال، گسترش تحقیقات در این زمینه می‌تواند گامی مؤثر در جهت توسعه‌ی روش‌های پایدار و سازگار با محیط زیست برای کنترل آفات جنگلی باشد (Choi & Park, 2012). در عرصه‌های جنگلی، طغیان برخی گونه‌های خسارت‌زا آفات موجب شکنندگی و حساسیت اکوسیستم‌های جنگلی شده و لزوم توجه به حمایت و تقویت عوامل کنترل‌کننده طبیعی آفات در این شرایط ملموس‌تر از پیش است. طبق راهنمای کنترل بیولوژیک آفات در جنگل‌ها توسط سازمان کشاورزی و غذا ملل متحد (FAO) توسطKenis et al. (2019)  در سال 2019، آفات جنگل را می‌توان با استقرار و استفاده از روش‌های بیولوژیک در چارچوب یک برنامه IPM مدیریت کرد. اولین پروژه کنترل بیولوژیک کلاسیک علیه آفات جنگلی با استفاده از پارازیتوئیدها و شکارگرها در سال 1905، در اروپا و ژاپن انجام شد (Doane & McManus, 1981). چهار استراتژی اصلی برای استفاده از عوامل بیمارگر حشرات در جنگل وجود دارد؛ روش اول معرفی عامل بیمارگر یا introduction به جمعیت آفت برای گسترش و انتشار دادن آن، روش دوم رهاسازی تلقیحی یا inoculative control به صورت سرکوب غیردائمی جمعیت آفت و تکرار تیمار با هر شیوع آفت و روش سوم انبوه‌سازی یا inundative control شامل کاربردهای مکرر در مقیاس وسیع، در نهایت روش چهارم، حفاظت و حمایت از جمعیت‌های طبیعی عوامل کنترل بیولوژیک یا conservation biological control است که بر حفظ زیستگاه، تقویت شرایط طبیعی و جلوگیری از تخریب اکولوژیکی تأکید دارد (Van Frankenhuyzen et al., 2009; Kenis et al., 2019).

در دنیا، برخی آفات راسته‌های سخت‌بالپوشان (Coleoptera)، جوربال و ناجوربال (Hemiptera)، زنبورها (Hymenoptera) و پروانه‌ها (Lepidoptera) در اکوسیستم‌های جنگلی هدف اقدامات مدیریتی مختلف از جمله کنترل میکروبی با استفاده از قارچ‌های بیمارگر بومی یا وارداتی قرار گرفته‌اند. از جمله برنامه‌های موفق و گسترده‌ی مقابله با آفات جنگلی با استفاده از قارچ‌های بیمارگر حشرات می‌توان به کنترل آفات برگ‌خوار کاج با Beauveria bassiana در چین (Li et al., 2009)، کنترل ملخ صحرایی Schistocerca gregaria با Metarhizium anisopliae var. acridum در آفریقا، استرالیا و چین (Lomer et al., 2001)، مدیریت آفت Ostrinia nubilalis با استفاده از B. bassiana در اروپا و آمریکا (Bing & Lewis, 1991, 1992; Lewis et al., 2002)، و کنترل آفت برگ‌خوار بلوط Porthesia melania در ایران با جدایه‌های بومی قارچ‌های بیمارگر حشرات B. bassiana و M. anisopliae اشاره کردد (Alinejad et al., 2025).  

تحقیق حاضر در جنگل‌های بلوط زاگرس در استان فارس، با هدف جمع‌آوری و شناسایی گونه‌های قارچ بیمارگر حشرات بومی، بررسی کارایی آن‌ها و همچنین ارزیابی پتانسیل برخی دیگر از قارچ‌های بیمارگر روی آفت شب‌پره برگ‌خوار بلوط در شرایط آزمایشگاهی و صحرایی طی دو سال متوالی انجام گرفت. همچنین نظـر بـه اینکـه چگونگی استفاده از عوامل کنترل کننـده، نقـش مهمـی در میزان تأثیر آن‌ها دارد، آزمایش‌های میدانی به گونه‌ای طراحی شد که قارچ‌های مورد نظر تنـه درختان بلوط (به‌عنوان مکان زمستان‌گذرانی لاروهای این آفت) را در زمستان پوشش داده تا زمانی که لاروها از محل‌های زمستانی از زیر پوستک درختان خارج و به سمت برگ‌ها و جوانه‌های نورسته شاخ و برگ حرکت می‌کنند، در معرض آلودگی به قارچ بیمارگر قرار گیرند. فرضیه آزمون بر این اساس بنا نهاده شد که کاربرد عوامل کنترل بیولوژیک روی تنه درختان بلوط، در مقایسه با روش متدوال پاشش روی شاخ و برگ، استراتژی مناسب‌تر و قابل اجراتری در جنگل هم به لحاظ زیست‌محیطی و هم از نظر اقتصادی می‌باشد و گام مهمی در راستای حفاظت و نگه‌داری رویشگاه‌های بلوط ایرانی خواهد بود.

مواد و روش­ها

جمع‌آوری و پرورش حشرات در آزمایشگاه. طی ماه‌های اردیبهشت تا خردادماه 1401، تخم‌های آفت برگ‌خوار سفید بلوط از درختان بلوط ایرانی آلوده در استان فارس (1044/29 درجه عرض شمالی و 0459/53 درجه طول شرقی) جمع‌آوری شد. لاروها در قفس‌های (20×30×30 سانتی‌متر) با سوراخ‌هایی که با توری ظریف پوشیده شده بودند در اتاقک‌های رشد 1±26 درجه سانتی‌گراد، رطوبت نسبی 2±65 درصد و دوره روشنایی 16:8 ساعت (L:D) نگهداری شدند تا لارو سن دوم به دست آید. تحت شرایط آزمایشگاهی برگ‌های تازه بلوط ایرانی روزانه در اختیار لاروها قرار گرفت. سن لاروی با حضور پوست‌های جدید و کپسول‌های سر تعیین شد.

جداسازی قارچ‌های بیمارگر حشرات. قارچ‌های بیمارگر از لاروهای آفت برگ‌خوار سفید بلوط که از زیر پوست درختان بلوط ایرانی (Q. brantii) مناطق مختلف جنگل‌های زاگرس در استان فارس جمع‌آوری شده بودند، جداسازی شدند. برای این منظور، حشرات آلوده به صورت سطحی، استریل شده و در محفظه مرطوب دسیکاتور تا ظهور میسلیوم فعال در حال رشد نگهداری شدند. میسلیوم رشدیافته، به محیط کشت سابورد دکستروز آگار (Sabouraud’s dextrose agar) حاوی 1 درصد عصاره مخمر (SDYA) منتقل شد و سپس جدایه‌های قارچی در محیط‌های انتخابی حاوی 40 گرم گلوکز، 10 گرم پروتئوز پپتون (proteose peptone)، 15 گرم آگار، 01/0 گرم کریستال ویولت (crystal violet)، 5/0 گرم سیکلوهگزامید (Cycloheximide)، 5/0 گرم کلرامفنیکل (chloramphenicol) و یک لیتر آب مقطر بازکشت شدند. تهیه کشت خالص از همه جدایه‌های بدست آمده با جداسازی تک اسپور (monosporic cultures) به دست آمد.

شناسایی جدایه‌های قارچ‌های بیمارگر حشرات و آنالیز فیلوژنتیک. شناسایی جدایه‌های قارچی ابتدا بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی انجام شد. بررسی‌های میکروسکوپی با استفاده از میکروسکوپ Olympus BX51 (ژاپن) بر روی کشت‌های خالص در محیط سابوردکستروز آگار حاوی عصاره مخمر (SDYA) صورت گرفت. ویژگی‌های ریختی از جمله شکل و اندازه کنیدی‌ها، نحوه رشد میسلیوم و ساختار کنیدی‌برها بررسی و با کلید شناسایی معتبر Humber (1998) مقایسه گردید. نتایج حاصل نشان داد که جدایه‌های مورد بررسی از نظر ریخت‌شناسی متعلق به گونه Beauveria bassiana هستند. برای تایید شناسایی‌های مورفولوژیکی، جدایه‌ای که در آزمایش‌های زیست‌سنجی، بیشترین بیماری‌زایی را روی حشره هدف داشت، مورد مطالعات مولکولی قرار گرفت. میسلیوم این جدایه پس از کشت در محیط مایع Sabouraud’s Dextrose Broth (SDB) حاوی دو درصد گلوکز، نیم درصد پپتون و نیم درصد عصاره مخمر به مدت ۹۶ ساعت در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. استخراج DNA ژنومی با روش Pfeifer & Khachatourians (1993) انجام شد؛ در این روش، میسلیوم پس از فیلتراسیون و شست‌وشو با آب مقطر استریل، در نیتروژن مایع پودر گردید، سپس با استفاده از بافر لیز حاوی SDS و EDTA تجزیه سلولی انجام شد. عصاره با مخلوط فنل–کلروفرم–ایزوآمیل‌الکل استخراج و DNA به‌وسیله ایزوپروپانول رسوب داده شد. رسوب DNA با اتانول ۷۰ درصد شسته و پس از خشک شدن در بافر TE حل گردید. برای انجام تجزیه و تحلیل ناحیه ژنیrDNA ITS ، از پرایمرهای ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) و   ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)برای تکثیر ناحیهITS، شاملITS1-5.8s-ITS2  استفاده شد (White et al., 1990). برای بررسی موفقیت تکثیر ناحیه ژنی استفاده شده، دو میکرولیتر از محصول PCR (Polymerase chain reaction) روی ژل آگارز حاوی DNA Green Viewer™  بارگذاری شد. محصولات PCR خالص‌سازی و توسط پرایمرهای ITS1 و ITS4 در مؤسسه ژنومیک پکن (Beijing Genomics Institute = GI) در چین توالی‌یابی شدند. توالی‌های نهایی در پایگاه اطلاعاتی GenBank ثبت گردیدند.

تهیه اسپور برای انجام زیست‌سنجی‌های آزمایشگاهی. از میان جدایه‌های مورد بررسی در آزمون‌های زیست‌سنجی، سه جدایه شامل B. bassiana B2، BG4 B. bassiana و M. anisopliae M1 که بیشترین میزان زهرآگینی و اثربخشی را علیه لاروهای L. wiltshirei نشان دادند، برای تولید اسپور و انجام آزمایش‌های صحرایی انتخاب شدند. به منظور تهیه کنیدی‌های تازه برای انجام زیست‌سنجی‌ها، جدایه‌های به‌دست‌آمده به مدت 14 روز در ظروف پتری حاوی محیط SDYA در دمای 1±24 درجه سانتی‌گراد کشت داده شدند. کنیدی‌ها با افزودن 10 میلی‌لیتر آب مقطر استریل حاوی 05/0 درصد (v/v) پخش‌کننده Tween^® 80 به سطح کلنی‌ها جمع‌آوری شدند. سوسپانسیون حاصل با استفاده از کاغذ صافی استریل (Whatman  no. 1) فیلتر و به یک فالکون استریل 50 میلی‌لیتری منتقل شد. غلظت سوسپانسیون قارچی با استفاده از یک لام هموسیتومتر در زیر میکروسکوپ نوری تعیین شد. غلظت سوسپانسیون‌های اولیه به 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر  رسانده شد. زنده‌مانی اسپورها با تلقیح مرکز ظروف پتری نه سانتی‌متری حاوی محیط SDYA با دو میکرولیتر از سوسپانسیون به دست آمده تایید شد. درصد جوانه‌زنی اسپورها 12 ساعت پس از تلقیح با شمارش 100 کنیدی در ظروف پتری اندازه‌گیری شد. سپس سایر غلظت‌های مورد نیاز برای آزمون‌های زیست‌سنجی روی حشره آفت در شرایط آزمایشگاهی، شامل غلظت‌های 10⁵، 10⁶، 10⁷ و 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر از سوسپانسیون اولیه گرفته شد. تیمارهای شاهد حاوی آب مقطر استریل شده به همراه 05/0 درصد (v/v) پخش‌کننده  Tween^® 80بود.

زیست‌سنجی‌‎های آزمایشگاهی روی آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط. در این پژوهش، دو گروه از جدایه‌های قارچی به‌منظور ارزیابی کارایی آن‌ها علیه آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط مورد استفاده قرار گرفتند؛ گروه نخست شامل یازده جدایه بومی جداسازی‌شده از لاروهای آلوده با کدهای BG1، BG2، BG3، BG4، BG5، BG6، BG7، BG8، BG9، BG10 و BG11 و گروه دوم متشکل از سه جدایه‌ی بیمارگر حشرات شامل B. bassiana (B2)، M. anisopliae (M1) و Lecanicillium lecanii (Vertalec) بود. در آزمایشگاه، حساسیت لاروهای سن دوم شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط به جدایه‌های قارچی در چهار غلظت مختلف 10⁵، 10⁶، 10⁷ و 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر مورد بررسی قرار گرفت. سوسپانسیون کنیدی هر جدایه بر اساس روش ذکرشده در بخش «تهیه اسپور برای انجام زیست‌سنجی‌های آزمایشگاهی» آماده گردید. لاروهای هر تیمار با غوطه‌ور شدن جداگانه در سوسپانسیون کنیدی به مدت 10 ثانیه تلقیح شدند و لاروهای شاهد در آب مقطر استریل حاوی 05/0 درصد Tween^® 80 قرار گرفتند. لاروهای تیمار شده به صورت جداگانه به ظروف پوشیده شده با کاغذ صافی استریل منتقل و به همراه برگ‌های تازه  Q. brantii در انکوباتور نگهداری شدند. برای هر تیمار 24 لارو در هر ظرف استفاده شد. آزمایش‌ها در پنج تکرار انجام شد. مرگ‌ومیر لاروها در اثر عفونت قارچی روزانه به مدت شش روز ثبت شد. لاروهای مرده به ظروف پتری استریل شده حاوی کاغذ صافی مرطوب منتقل شدند و به مدت پنج روز در دسیکاتور نگهداری شدند و مورد بررسی قرار گرفتند (شکل 1). تنها لاروهایی که در دوران نگهداری در دسیکاتور با میسلیوم سفید و اسپورهای قارچی پوشیده شدند به عنوان لاروهای مرده در اثر عفونت قارچی در نظر گرفته شدند.

تولید بلاستوسپور. برای تولید بلاستوسپور روش‌های ارائه شده توسط et al. (1994) Feng و  Mascarin &  Jaronski (2016)با برخی تغییرات و بهینه‌سازی به‌کار گرفته شد. به منظور (برای تهیه) کشت اولیه، جدایه‌های منتخب در حجم کمی از محیط نمکی پایه (the basal salt medium) کشت داده شد، سپس 10 میلی‌لیتر Tween^® 80 استریل 1/0 درصد به پلیت‌های هفت روزه اضافه شد و کنیدی‌ها با استفاده از حلقه تلقیح (inoculation loop) جمع‌آوری و به یک فالکون استریل منتقل شد. سوسپانسیون اسپور به میزان 10⁶ کنیدیوم در میلی‌لیتر تهیه شد. سپس به عنوان کشت اولیه در ارلن مایر 250 میلی‌لیتری، 15 میلی‌لیتر از این سوسپانسیون در 150 میلی‌لیتر محیط نمکی پایه تلقیح شد و به مدت سه روز در دمای 25 درجه سانتی‌گراد روی شیکر چرخشی با سرعت 350 دور در دقیقه نگهداری شد (Mascarin & Jaronski, 2016). در طول فرآیند تولید اسپور، ارلن‌ها به طور مرتب متوقف و تکان داده می‌شدند تا رشد میسلیوم روی دیواره‌ها به حداقل برسد و از بین برود. به منظور تلقیح کشت مایع حاوی حاوی بلاستوسپور قارچ به محیط جامد، از جو پرک استفاده شد. 300 گرم از جو پرک شسته شد و به مدت 20 دقیقه در آب مقطر جوشانده شد. سپس در کیسه‌های پلاستیکی قابل اتوکلاو ریخته و به مدت یک ساعت با فشار 15 پوند بر اینچ مربع و دمای 121 درجه سانتی‌گراد اتوکلاو شدند. پس از سرد شدن، 20 میلی‌لیتر کشت مایع حاوی حاوی بلاستوسپور قارچ به طور جداگانه به هر کیسه پلاستیکی حاوی جو تلقیح شد (شکل 2). تمام این مراحل در محفظه جریان هوای آرام انجام شد. کیسه‌های پلاستیکی تلقیح شده در انکوباتور در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به مدت سه هفته نگهداری شدند. پس از سه هفته، کیسه‌های حاوی اسپور و محیط کشت جامد جهت خشک شدن به پاکت‌های کاغذی متنقل شدند و در انکوباتور به مدت 15 روز نگهداری شدند. جهت جداسازی و خالص‌سازی اسپورها از محیط کشت جامد از دستگاه Micoharvester استفاده شد. اسپورهای جداسازی شده تا زمان انجام آزمون‌های بعدی در دمای چهار درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

شکل 1-  ظروف حاوی لاروهای شب‌پره سفید بلوط تیمار شده با قارچ‌های بیمارگر در انکوباتور

Fig. 1. Leucoma wiltshirei larvae treated with entomopathogenic fungi inside the containers in the incubator

شکل 2- تلقیح قارچ روی محیط‌های جامد

Fig. 2. Fungal inoculation on the solid culture media

تولید فرمولاسیون حشره‌کش قارچی. پودر اسپور قارچ‌های B. bassiana (جدایه‌های B2 و (BG4 و M. anisopliae جدایه M1 تولید شد. به‌منظور افزایش میزان زنده‌مانی جدایه‌های قارچی مورد آزمایش از دو نوع از فرمولاسیون مایع امولسیون شونده (EC) استفاده شد. فرمولاسیون نوع یک، از سه میلی‌لیتر سورفکتانت غیریونی بر پایه مشتقات الکل‌های چرب اتوکسیله و یک گرم پودر اسپور (10⁹ اسپور در گرم) و فرمولاسیون نوع دو، از دو میلی‌لیتر سورفکتانت غیریونی، شش میلی‌لیتر پارافین و یک گرم پودر اسپور (10⁹ اسپور در گرم) به دست آمدند. حجم هر دو مخلوط با افزودن آب مقطر استریل به 1000 میلی‌لیتر افزایش یافت، سپس در 50 دور در دقیقه و دمای پایین‌تر از 10 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه همگن شدند.

بیماری‌زایی فرمولاسیون‌های حشره‎کش قارچی روی آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط در شرایط صحرایی. دو نوع فرمولاسیون مایع امولسیون شونده علیه لاروهای سن دوم شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط مورد آزمایش قرار گرفتند. فرمولاسیون‌های بدون قارچ و آب مقطر استریل به تنهایی به عنوان شاهد استفاده شد. آزمایش‌های عرصه‌ای با جدایه‌هایB. bassiana B2 ، B. bassiana BG4  و M. anisopliae M1 انجام شد. آزمایش‌های زیست‌سنجی صحرایی روی مرحله زمستان گذران آفت (لارو سن دو و سه) زیر پوست تنه درختان بلوط ایرانی Q. brantii در منطقه رستم در استان فارس (۳۰ درجه و ۳۷ دقیقه عرض شمالی و ۵۱ درجه و ۵۳ دقیقه طول شرقی) و در دو سال متوالی (آذر سال‌های 1402 و 1403) انجام شد. فرمولاسیون‌های تهیه شده با استفاده از طرح بلوک‌های کامل تصادفی (randomized complete block design=RCBD)، شامل نه تیمار (دو فرمولاسیون مایع امولسیون شونده برای هر جدایه، تیمار شاهد و دو فرمولاسیون بدون قارچ) در پنج تکرار (درخت) مورد ارزیابی قرار گرفتند (شکل 3).

درختان بلوط به فاصله حداقل پنجاه متر از یکدیگر برای زیست‌سنجی عرصه‌ای انتخاب و به صورت تصادفی در تیمارها مورد استفاده قرار گرفتند. نمونه‌برداری از زیر پوست درختان جهت اطمینان از حضور آفت انجام شد. همچنین این درختان قبلاً با هیچ نوع حشره‌کشی تیمار نشده بودند. در هر تکرار ده قطعه نمونه از پوست درخت با اندازه‌های نسبتاً مساوی به طور تصادفی از تمام جهات درخت مورد بررسی برای شمارش آماری انتخاب شد. برای تعیین سطح جمعیت لارو، در هر تکرار درست قبل از محلول‌پاشی یک پیش شمارش صورت گرفت. درختان هر تیمار با استفاده از سمپاش دستی پنج‌ لیتری (با نازل و قفل ماشه قابل تنظیم) اسپری شدند. برای هر قارچ، محلول اسپری شامل سوسپانسیون کنیدی با غلظت 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر بود. برای اطمینان از پوشش کامل تنه، حدود پنج تا شش لیتر از محلول برای هر درخت استفاده شد. درختان تیمار شده 3، 7، 11 و 30 روز پس از تیمار مورد نمونه‌برداری قرار گرفتند تا میزان مرگ‌ومیر لاروها بررسی شود. میزان تلفات به صورت تعداد لارو مرده در زیر پوست هر درخت نسبت به تعداد کل لاروها در زیر پوست هر درخت (dead larvae per tree truck/total number of larvae per tree truck) محاسبه شد. داده‌‎های مرگ‌ومیر برای جبران مرگ‌های طبیعی با استفاده از فرمول ابوت (Abbott’s formula) تصحیح شدند (Abbott, 1925). پس از تیمار، لاروهای مرده به طور تصادفی از زیر پوست درختان تیمار شده جمع‌آوری و در در ظروف پلاستیکی به آزمایشگاه انتقال داده شدند. جداسازی مجدد قارچ بیمارگر از لاروهای مرده با استفاده از روشی که در آزمون جداسازی قارچ توضیح داده شد برای تأیید عفونت لارو به قارچ انجام شد.

تجزیه و تحلیل داده‌ها. داده‌‌ها با استفاده از تجزیه و تحلیل واریانس سه عاملی (Three-way ANOVA) در نرم‌افزار SAS (SAS Institute Inc., 2002) مورد بررسی قرار گرفتند. در این تحلیل، درصد مرگ‌ومیر لاروها به‌عنوان متغیر پاسخ و زمان قرارگیری در معرض (روز نمونه‌برداری)، غلظت سوسپانسیون کنیدی قارچ‌های بیمارگر (10⁵، 10⁶، 10⁷ و 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر) و نوع جدایه قارچی به‌عنوان عوامل اصلی در نظر گرفته شدند. مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن (Duncan’s Multiple Range Test) در سطح خطای 01/0=α انجام شد. مقادیر LC₅₀ (Median Lethal Concentration) و LC₉₀ (Lethal Concentration for 90%  mortality) قارچ‌های بیمارگر و میانه زمان کشنده LT₅₀ (Median Lethal Time) با استفاده از تجزیه و تحلیل پروبیت در نرم‌افزارSPSS  (SPSS Inc., 2008) برآورد شد.

شکل 3- لاروهای زمستان گذران شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط در زیر قطعه نمونه پوست درخت

Fig 3. Overwintering larvae of the oak defoliator, Leucoma wiltshirei beneath a piece of tree bark

درخت فیلوژنتیک حاصل از داده‌های ITS با استفاده از روش احتمال بیزی (Bayesian 50% majority rule consensus tree) و مدل تکاملیGTR+G+I  بازسازی شد. تحلیل‌ها با استفاده از نرم‌افزار PAUP ver. 4.0b10 انجام گرفت و تعداد تکرارها (MCMC generations) برابر با 1,000,000 بود؛ در هر 100 مرحله یک درخت نمونه‌برداری شد و 25 درصد از نمونه‌ها برای گرم شدن زنجیره‌ها (burn-in) حذف گردید.

نتایج

جدایه‌های قارچی بدست آمده. در مجموع یازده جدایه قارچی خالص از لاروهای L. wiltshirei در زیر پوست درختان بلوط ایرانی از مناطق مختلف جنگل‌های زاگرس در استان فارس جداسازی و از نظر مورفولوژیکی به عنوان گونه B. bassiana شناسایی شدند. این جدایه‌ها با کدهای BG1، BG2، BG3، BG4، BG5، BG6، BG7، BG8، BG9، BG10 و BG11 نام‌گذاری شدند و همگی از نمونه‌های لارو آلوده L. wiltshirei جمع‌آوری‌شده از استان فارس (مختصات جغرافیایی 30 درجه و 37 دقیقه عرض شمالی و 51 درجه و 53 دقیقه طول شرقی) به‌دست آمدند. نتایج شناسایی مولکولی نیز این جدایه‌ها را در یک شاخه با سایر جدایه‌های Beauveria bassiana قرار داد و شباهت بالای آن‌ها را با توالی‌های ثبت‌شده در GenBank نشان داد (شکل 4). همچنین در این پژوهش از سه جدایه قارچی بیمارگر دیگر نیز جهت انجام آزمایش‌های مقایسه‌ای استفاده شد (جدول 1).

شکل 4- درخت فیلوژنتیکی جدایه‌های Beauveria bassiana بر اساس ناحیه ITS rDNA و مقایسه آن‌ها با توالی‌های ثبت‌شده در GenBank. اعداد روی شاخه‌ها نشان‌دهنده مقادیر Bootstrap هستند.

Fig. 4. Phylogenetic tree of Beauveria bassiana isolates based on ITS rDNA region and their comparison with sequences deposited in the GenBank. Numbers on branches indicate bootstrap values.

شکل 5- مرگ‌ومیر جدایه‌های Beauveria bassiana روی لاروهای سن دوم Leucoma wiltshirei در غلظت‌های 0، 10⁷ و 10⁸ کنیدی در میلی­لیتر، 24 و 48 ساعت بعد از تیمار (میانگینSE±)

Fig. 5. Mortality rate caused by Beauveria bassiana isolates on second-instar larvae of Leucoma wiltshirei at concentrations of 0, 10⁷, and 10⁸ conidia per mL, 24 and 48 hours after treatment (mean±SE).

زیست‌سنجی‌‏های آزمایشگاهی جدایه‌های B. bassiana روی آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط. بر اساس نتایج این پژوهش در غربالگری اولیه و در شرایط آزمایشگاهی، هر یازده جدایه قارچ B. bassiana (BG1، BG2، BG3، BG4، BG5، BG6، BG7، BG8، BG9، BG10 و BG11) علیه لاروهای سن دوم شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط در غلظت‌‏‌های 10⁷ و 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر، بیماری‌زا بودند؛ درصد مرگ‌ومیر در بین جدایه‌ها با یکدیگر متفاوت بود. بیش‌ترین میزان مرگ‌ومیر لارو شب‌پره سفید بلوط توسط جدایه B. bassiana BG4 در غلظت 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر 48 ساعت پس از تیمار 3/33 درصد بود (شکل 5). در غلظت 10⁸ کنیدی در میلی‌لیتر و 48 ساعت پس از تیمار، جدایه B. bassiana BG4 بالاترین میزان مرگ‌ومیر را داشت که به طور معنی‌داری بیشتر از مرگ‌ومیر ایجاد شده توسط سایر جدایه‌های قارچی مورد آزمایش بود (0001/0>F_10,22= 12.67; p) (جدول 2).

شکل 6- مرگ‌ومیر جدایه‌های Beauveria bassiana (B2, BG)، Metarhizium anisopliae (M1) وLecanicillium lecanii (Vertalec)  روی لاروهای سن دوم Leucoma wiltshirei در غلظت‌های ۰، ۱۰⁵، 10⁶، 10⁷ و 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر، در زمان‌های ۲۴، ۴۸، ۷۲، ۹۶، ۱۲۰ و ۱۴۴ ساعت پس از تیمار (میانگینSE±).

Fig. 6. Mortality of Beauveria bassiana isolates (B2 and BG), Metarhizium anisopliae (M1), and Lecanicillium lecanii (Vertalec) against second-instar larvae of Leucoma wiltshirei at concentrations of 0, 10⁵, 10⁶, 10⁷, and 10⁸ conidia per mL, 24, 48, 72, 96, 120, and 144 hours after treatment (mean±SE).

زیست‌سنجی‌‏های آزمایشگاهی جدایه منتخب B. bassiana و سایر جدایه‌های قارچی روی آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط. نتایج این تحقیق نشان داد که در شرایط آزمایشگاهی، هر چهار جدایه قارچی B. bassiana (B2, BG)، M. anisopliae (M1) و L. lecanii (Vertalec) برای لاروهای سن دوم شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط در غلظت‌های 10⁵، 10⁶، 10⁷ و 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر، بیماری‌زا بودند؛ نرخ مرگ‌ومیر در میان جدایه‌ها متفاوت بود (شکل 6). میزان مرگ‌ومیر بسته به جدایه‌های مختلف قارچی، غلظت اسپور و تعداد روزهای پس از تیمار به طور معنی‌داری متفاوت بود (0001/0>F_15,80= 19.63; p) (جدول 3). در تیمار شاهد، مرگ‌ومیر لاروها کمتر از ۵ درصد بود. در غلظت 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر و 144 ساعت پس از تلقیح، جدایه B. bassiana B2 بالاترین میزان مرگ‌ومیر (66/94 درصد) را داشت که به طور معنی‌داری بیشتر از مرگ‌ومیر ایجاد شده توسط B. bassiana BG (84 درصد)، M. anisopliae M1 (62 درصد) و L. lecanii Vertalec (40 درصد) بود (0001/0>p).

1. B. bassiana BG4 پس از B. bassiana B2 دومین جدایه با بیش‌ترین میزان مرگ‌ومیر روی لاروهای آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط بود که 76 درصد تلفات لاروی در غلظت 10⁷ کنیدیوم در میلی‌لیتر و 84 درصد مرگ‌ومیر در غلظت 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر در 144 ساعت پس از تیمار را به همراه داشت (0001/0>p). کمترین درصد مرگ‌ومیر در لاروها مربوط به جدایه L. lecanii (Vertalec) با 40 درصد تلفات در غلظت 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر در 144 ساعت پس از تیمار بود (0001/0>p). در 96 ساعت پس از تیمار، B. bassiana B2 دارای پایین‌ترین غلظت کشنده 50 درصد (LC₅₀) را داشت و این مقدار برابر با 10⁵×1/2 کنیدی در میلی­لیتر بود، در حالی که lecanii Vertalec بالاترین LC₅₀ را با مقدار 10¹³×9/1 کنیدیوم در میلی‌لیتر روی لاروهای سن دوم آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط نشان داد (جدول 4). مقادیر LT₅₀ محاسبه شده برای B. bassiana B2، B. bassiana BG و M. anisopliae M1 به ترتیب 8/72، 85/88 و 160 ساعت در غلظت 10⁷ کنیدیوم در میلی‌لیتر بود (جدول 5).

بیماری‌زایی فرمولاسیون‌های حشره‌کش‌های قارچی روی آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط در شرایط صحرایی. تأثیر دو فرمولاسیون از هر یک از قارچ‌های بیمارگر (B2 و BG) B. bassiana و M. anisopliae (M1) (B2+Formulation 1، B2+Formulation 2، BG+Formulation 1، BG+Formulation 2، M1+Formulation 1 و M1+Formulation 2) روی لاروهای آفت برگ‌خوار سفید بلوط در منطقه رستم در استان فارس طی دو سال متوالی مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج آزمایش‌های میدانی نشان داد که میانگین مرگ‌ومیر ناشی از کاربرد فرمولاسیون‌های قارچی در دو سال متوالی اختلاف معنی‌داری با یکدیگر نداشت (1311/0F_15,80= 19.63; p=). در مقابل، فرمولاسیون‌های قارچی تأثیر معنی‌داری بر مرگ‌ومیر لاروهای شب‏پره سفید بلوط داشتند (0001/0>F_8,288= 11797; p). همچنین، اثر متقابل تیمارها (سال و زمان) و فرمولاسیون‎های قارچی معنی‌دار بود (0001/0>F_24,288= 2.10; p) (جدول 6). در سال اول، فرمولاسیون نوع دو جدایه B2 نسبت به سایر تیمارها برتری قابل توجهی داشت و باعث مرگ‌ومیر 73 درصدی لاروهای آفت برگ‌خوار بلوط، 30 روز پس از تیمار تنه درختان بلوط شد (جدول 7). فرمولاسیون نوع دو جدایه‌های BG و M1 به ترتیب با میزان مرگ‌ومیر 62 و 54 درصد در رتبه بعدی قرار دارند (شکل 7). درصد مرگ لاروها در سال دوم آزمایش روندی مشابه با سال اول داشت. فرمولاسیون نوع دو جدایه B2 2/75 درصد مرگ‌ومیر را 30 روز پس از تیمار ایجاد کرد. این میزان به طور قابل توجهی بیشتر از سایر تیمارها بود که شامل میزان مرگ‌ومیر حاصل از فرمولاسیون نوع دو جدایه‌های BG و M1 بود به ترتیب با 61 درصد و 8/54 درصد بود (0001/0>p) (شکل 8).

بحث و نتیجه‌گیری

نتایج این پژوهش نشان داد که از گونه B. bassiana بطور طبیعی در زیستگاه‌های آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط گسترده هستند، زیرا این گونه قارچی از لاروهای جمع‌آوری‌شده از جنگل‌های تحت بررسی به دفعات متعدد جدا شد. تفاوت مشاهده‌شده در ویژگی‌های کیفی و کمی جدایه‌های به‌دست‌آمده می‌تواند ناشی از عوامل متعددی باشد که بر ترکیب گونه‌ای و فراوانی قارچ‌های بیمارگر حشرات در زیستگاه‌های طبیعی تأثیر می‌گذارند (Dyczko et al., 2024). مسلماً، داشتن شناخت کافی از ترکیب و توزیع گونه‌های بومی قارچ‌های بیمارگر حشرات در ارزیابی اثربخشی و پتانسیل آنها در کنترل بیولوژیک در یک اکوسیستم خاص بسیار مهم است.

علاوه بر این، تغییرات سریع اقلیمی و سایر دگرگونی‌های زیست‌محیطی اخیر، ضرورت گسترش دانش ما درباره گونه‌های قارچی بومی را بیش از پیش آشکار می‌سازد. درک چگونگی تعامل این قارچ‌ها با میزبانان بندپا در اکوسیستم‌های در حال تغییر، برای پیش‌بینی تأثیرات آنها بر پویایی جمعیت آفت و برای توسعه استراتژی‌های مدیریت پایدار جمعیت آفت ضروری است؛ چراکه تنها در اینصورت می‌توان از آفت‌کش‌های زیستی مبتنی بر قارچ برای کنترل جمعیت آفت با شرایطی که با محیط زیست سازگار و از نظر اقتصادی مقرون بصرفه باشد، در قالب یک استراتژی مدیریت پایدار جمعیت آفت بهره برد (Sullivan et al., 2022). در این مطالعه بیمارگری 11 جدایه بومی B. bassiana که از زیستگاه‌های جنگلی محل زندگی آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط جداسازی شده بودند،  در آزمون‌های زیست‌سنجی ارزیابی شد. علاوه بر این، سه جدایه قارچی دیگر شامل B. bassiana B2، M. anisopliae M1 وL. lecanii Vertalec نیز در شرایط آزمایشگاهی علیه لاروهای سن دوم این آفت مورد ارزیابی قرار گرفتند. نتایج زیست‌سنجی نشان داد که تمام جدایه‌های قارچی دارای فعالیت بیمارگری علیه لاروهای سن دوم بودند، با این حال میزان مرگ‌ومیر ناشی از آن‌ها تفاوت قابل‌توجهی داشت. بر اساس نتایج آزمایشگاهی و نیز میدانی پژوهش، لاروهای آفت شب‌پره برگ‌خوار سفید بلوط نسبت به جدایه‌های قارچ‌ بیمارگر B. bassiana حساسیت بالاتری نسبت به سایر گونه‌های قارچی مورد آزمایش داشتند. پایین‌تر بودن بیماری‌زایی L. lecanii احتمالاً به حساسیت بالاتر کنیدی‌ها به اشعه فرابنفش و کاهش بقاء آن در شرایط خشک محیطی مربوط است (Braga et al., 2001). همچنین، با افزایش زمان قرار گرفتن لاروها در معرض قارچ و غلظت بالاتر اسپور این قارچ‌ها، اثربخشی آن‌ها افزایش یافت. این نتیجه با یافته Zamani et al. (2023) مطابقت دارد. طبق نتایج ایشان غلظت 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر از سوسپانسیون حاوی جدایه B. bassiana B2 باعث مرگ‌ومیر 100 درصدی لاروهای Cydalima perspectalis در شرایط آزمایشگاهی شد. همچنین B. bassiana B2 بر سایر جدایه‌های مورد مطالعه Zamani et al. (2023) برتری داشت و با مقادیر پایین LC₅₀ (10⁷×2/1 کنیدیوم در میلی‌لیتر، ۹۶ ساعت پس از تیمار) و  LT₅₀(93/73 ساعت در غلظت 10⁷ کنیدیوم در میلی‌لیتر) این برتری نشان داده شد.

شکل 7- درصد مرگ‌ومیر تصحیح شده (فرمول ابوت) لاروهای Leucoma wiltshirei، 3، 7، 11 و 30 روز بعد از پاشش در آزمون صحرایی (منطقه رستم) در استان فارس در سال اول

Fig. 7. Corrected mortality percentage (Abbott’s formula) of Leucoma wiltshirei larvae at 3, 7, 11, and 30 days after spraying in field trials (Rostam region, Fars Province) in the first year

شکل 8- درصد مرگ‌ومیر تصحیح شده (فرمول ابوت) لاروهای Leucoma wiltshirei، 3، 7، 11 و 30 روز بعد از پاشش در آزمون صحرایی (منطقه رستم) در استان فارس در سال دوم

Fig. 8. Corrected mortality percentage (Abbott’s formula) of Leucoma wiltshirei larvae at 3, 7, 11, and 30 days after spraying in field trials (Rostam region, Fars Province) in the second year

بر اساس نتایج تحقیق حاضر، مقادیر میانگین غلظت کشنده (LC₅₀) جدایه‌های B2، B. bassiana B2 و B. bassiana BG4 به ترتیب 10⁵×1/2 و 10⁷×2/1 کنیدیوم در میلی‌لیتر، 96 ساعت پس از تیمار روی لاروهای سن دوم L. wiltshirei محاسبه گردید. به طور مشابه، Hu et al. (2021) مقادیر LC₅₀ جدایه‌های B. bassiana Bb10331 و Bb7725 را در برابر لارو شب‌پره برگخوار سفید امریکایی ((Hyphantria cunea (Drury) (Lepidoptera: Arctiidae) به ترتیب 10⁶×72/4 و 10⁶×28/3 کنیدیوم در میلی‌لیتر 120 ساعت پس از تیمار تعیین کردند. همچنین، Alinejad et al. (2025) در پژوهشی روی شب‌پره گزنده بلوط P. melania نشان دادند که جدایه‌های بومیB. bassiana ، به‌ویژهBG ، در غلظت 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر منجر به ۱۰۰ درصد مرگ‌ومیر لاروها در هر دو روش غوطه‌وری و پاشش شدند. این نتایج، هم‌سو با یافته‌های پژوهش حاضر، بر پتانسیل بالای جدایه‌های B. bassiana در کنترل زیستی آفات برگ‌خوار جنگلی تأکید می‌کند.

از آنجاکه فراتر رفتن از شرایط آزمایشگاهی به سمت آزمایش‌های میدانی، داده‌های ارزشمندی در مورد اثربخشی قارچ‌های بیمارگر حشرات در دنیای واقعی در کنترل جمعیت آفات ارائه می‌دهد و این مطالعات می‌توانند چالش‌های عملی و تأثیر شرایطمحیطی بر اثربخشی قارچ‌های بیمارگر را آشکار کنند، در این تحقیق بررسی عملکرد قارچ‌های بیمارگر روی آفت شب‌پره برگ‌خوار بلوط از طریق کاربرد اسپری‌پاشی تنه درختان در شرایط صحرایی طی دو سال متوالی انجام گرفت. نتایج آزمون‌های صحرایی این تحقیق در طی دو سال متوالی نشان داد که افزودن مایع امولسیون کننده به فرمولاسیون قارچی بیشترین مرگ‌ومیر را روی لاروهای آفت شب‌پره برگ‌خوار بلوط کرد. محلول‌پاشی فرمولاسیون‌های جدایه‌های B2 و BG4 حاوی سورفکتانت غیریونی و پارافین روی تنه درختان بلوط منجر به مرگ‌ومیر 75-73 و 62-61 درصدی جمعیت آفت 30 روز پس از تیمار شد. این فرمولاسیون از قارچ بیمارگر حشرات بالاترین پتانسیل برای کنترل آفت را داشت و فرمولاسیون جدایه‌های B2 و BG4 حاوی سورفکتانت غیریونی بر پایه مشتقات الکل‌های چرب اتوکسیله با ایجاد 63-61 و 56-54 درصد تلفات در رتبه بعدی قرار گرفتند. نتایج مشابهی در پژوهش‌های میدانیLuz & Batagin (2005)  گزارش شده است. این محققان نشان دادند که فرمولاسیون روغنی B. bassiana در کنترل پوره‌های Triatoma infestans (Klug, 1834) (Hemiptera: Reduviidae)در شرایط میدانی موجب افزایش معنی‌دار کارایی قارچ شد، به‌طوری‌که تیمار روغنی در غلظت 10⁸ کنیدیوم در میلی‌لیتر باعث مرگ‌ومیر ۷۶ تا ۸۸ درصدی حشرات پس از ۲۱ روز گردید، در حالی‌که فرمولاسیون آبی تنها حدود ۵۰ درصد تلفات ایجاد کرد. این پژوهش تأیید می‌کند که افزودن روغن به فرمولاسیون قارچ‌های بیمارگر، پایداری کنیدی‌ها را در برابر اشعه فرابنفش و خشکی افزایش داده و در نتیجه، اثربخشی قارچ را در شرایط صحرایی به‌طور بهبود می‌دهد. در دیگر مطالعات نیز، قارچ‌های فرموله شده با روغن‌ها نتایج خوبی در کنترل بیولوژیکی آفات حشره‌ای در شرایط عرصه‌ای نشان داده‌اند (Batta, 2003). این پتانسیل به توانایی روغن در محافظت از کنیدی‌های قارچی در برابر شرایط نامطلوب محیطی، به ویژه اشعه ماوراء بنفش و درنتیجه طولانی شدن ماندگاری در عرصه نسبت داده می‌شود (Daoust et al., 1983; Jaronski, 2010). روغن همچنین بهتر از آب با کوتیکول چربی‌دوست حشره ترکیب شده و به سرعت پخش می‌شود و احتمالاً اسپورهای قارچ را به سطح بدن حشره منتقل می‌کند (Wraight et al., 2001). Luz و Batagin (2005) گزارش کردند که کنیدی‌های B. bassiana در روغن ذرت (5/92 درصد) و پس از آن خار مریم (8/32 درصد)، بزرک (27 درصد) و روغن سویا (19 درصد) بهتر جوانه می‌زنند. شب‌پره L. wiltshirei یکی از آفات مخرب و مهم است که به درختان بلوط ایرانی در جنگل‌های زاگرس ایران آسیب جدی وارد کرده است. عوامل کنترل میکروبی، از جمله قارچ‌ها، روش مؤثرتر و پایدارتری برای مدیریت آفات ارائه می‌دهند.

با توجه به ملاحظات ایمنی محیطی و پایداری اکوسیستم، استفاده از جدایه‌های بومی در برنامه‌های کنترل میکروبی، رویکرد مطلوب‌تری به نظر می‌رسد. اگرچه شرایط محیطی و در دسترس بودن میزبان از عوامل مهم در حفظ جمعیت این آفت هستند، اما وجود قارچ‌های بیمارگر حشرات در اکوسیستم نیز مسلماً بر پویایی جمعیت آفت تأثیرگذار است. این مطالعه حضور رایج قارچ‌های بیمارگر حشرات از گونه B. bassiana در زیستگاه آفت برگخوار سفید بلوط را با پتانسیل کشنده علیه جمعیت محلی این آفت آشکار کرد. قارچ‌های بیمارگر حشرات با منبع محلی به خوبی با شرایط ریزاقلیمی محلی سازگار هستند و آنها را به کاندیداهای امیدوارکننده‌ای برای کنترل بیولوژیک تبدیل می‌کنند. نتایج تحقیق حاضر نشان داد که جدایه‌ بومی B. bassiana BG4 عامل کنترل بیولوژیکی امیدوارکننده علیه مراحل لاروی آفت برگ‌خوار سفید بلوط می‌باشد. با این وجود، برای پیشبرد این یافته‌ به سمت کاربردهای عملی، استفاده از فرمولاسیون مناسب برای حفظ بهتر اسپورهای قارچی و کاربرد فرمولاسیون در محل مناسب روی درخت (محل تجمع آفت) جهت اثربخشی و ایمنی قارچ‌های بیمارگر حشرات در زیستگاه‌های طبیعی مورد نیاز بود؛ که مد نظر ما قرار گرفت و به مرحله اجرا درآمد.

نتایج این تحقیق نشان داد که در شرایط صحرایی کاربرد فرمولاسیون مایع امولسیون شونده ازB. bassiana BG4  شامل سورفکتانت غیر یونی و پارافین در برابر لاروهای آفت L. wiltshirei فرمولاسیون مناسبی بوده و مرگ‌ومیر بالایی را ایجاد نموده است. این فرمولاسیون می‌تواند مد نظر تولیدکنندگان محصولات بیولوژیک علیه این آفت قرار گیرد. آغشـته کـردن تنـة درختان، بعنوان روشی منطبق با زیست‌شناسی آفت برگخوار سفید بلوط، کاربردی مناسب از قارچ‌های بیمارگر بر علیه این آفت را ایجاد نمود. در ایـن کاربرد، لاروهای کوچک سنین اولیة یک و دو که به آرامی همراه با مکث‌هـای طولانی از تنة درخت بالا می‌رونـد در معرض عفونت قارچ بیمارگر قرار می‌گیرند. به‌عنوان یک یافته عملی و بر اساس نتایج بدست آمـده در آزمایش‌های این تحقیق، بـا کـانون‌یـابی و شناسـایی مناطق تجمـع آفت برگخوار سفید بلوط در سـال قبـل و اسـتفاده از فرمولاسیون قارچ B. bassiana روی تنه درختان در زمان زمستان‌گذرانی آفت (بـا حمایـت نهادهای مسئول و بهره‌گیری از افراد محلی)، می‌تواند به کنترل مؤثر، عملی و کم‌هزینه آفت در عرصه‌های جنگلی منجر شود. همچنین، انجام مطالعات بیشتر برای بررسی پایداری فرمولاسیون‌های قارچی در شرایط اقلیمی گوناگون و ارزیابی تأثیر آن‌ها بر دشمنان طبیعی و سایر حشرات غیرهدف ضروری است. چنین پژوهش‌هایی می‌تواند به بهبود اثربخشی و ایمنی زیستی قارچ‌های بیمارگر در محیط‌های طبیعی کمک کرده و زمینه‌ساز توسعه راهکارهای پایدار در مدیریت تلفیقی آفات جنگلی باشد.

Author Contributions

Seyede Masoomeh Zamani: project administration and funding acquisition, investigation, methodology, draft preparation; Marzieh Alinejad: methodology, formal analysis, visualization, Hassan Askary: methodology, final review and edit; Reihaneh Gholami Gavamabad: final review and edit, Narges Sepasi: final review and edit, Samira Farahani: final review and edit, Yazdanfar Ahangaran: field experiments and coordination

Author's Information

Funding

This research was carried out with the financial support of the Natural Resources and Watershed Management Organization of Iran and in collaboration with the General Office of Natural Resources and Watershed Management.

Data Availability Statement

All data supporting the findings of this study are available within the paper.

Acknowledgments

This research was carried out with the financial support of the Nature Resources and Watershed Management Organization of Iran and in collaboration with the General office of Natural Resources and Watershed Management of Fars Province, for which we hereby express our gratitude. In addition, we extend our appreciation to the anonymous referees and the editor for their valuable.

Ethics Approval

This study involved the use of entomopathogenic fungi and plant-based solid substrates. All applicable international, national, and institutional guidelines for the ethical use of microbial agents in research were followed. This article does not contain any studies involving human participants or vertebrate animals performed by any of the authors.

Conflict of Interests

The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this paper.

Generative AI statement

The authors declare that no Gen AI was used in the creation of this manuscript.

Field performance of trunk-applied entomopathogenic fungi for management of the oak moth, Leucoma wiltshirei Coll. (Lep., Erebidae) during a two-year study

Seyede Masoomeh Zamani¹ , Marzieh Alinejad¹ , Hassan Askary² , Reihaneh Gholami Ghavamabad¹ , Narges Sepasi¹,  Samira Farahani¹  & Yazdanfar Ahangaran³

• Research Institute of Forests and Rangelands (RIFR), Tehran, Iran
• Iranian Research Institute of Plant Protection (IRIPP), Tehran, Iran
• Forests, Range and Watershed Management Organization, Chalous, Mazandaran, Iran