The effect of adding kombucha to sugar syrup on wax glands, hypopharyngeal glands, venom production, and overwintering performance of honey bee (Apis mellifera L.) colonies

مقدمه

زنبورعسل (Apis mellifera L.) برای ادامه حیات، فعالیت و رشدونموی خود، نیاز به شش گروه مواد مغذی از جمله کربوهیدرات­ها، پروتئین­ها، چربی­ها، مواد معدنی، ویتامین­ها و آب دارد که در صورت غنی بودن طبیعت، این مواد را از طریق جمع­آوری شهد و گرده از گل­های گیاهان زراعی، باغی، مرتعی و جنگلی در طبیعت به­دست می­آورد (Salehpor et al., 2024). کمیاب شدن گیاهان شهدزا و گرده­زا به علت شرایط خاص آب و هوایی در طبیعت و تأثیرات منفی تغییرات اقلیمی و ریزگردها در سال­های اخیر روی گلدهی گیاهان شهدزا و گرده­زا، منجر به کاهش تخمریزی ملکه، کاهش رشد جمعیت، کاهش طول عمر زنبورها، کاهش مقاومت در برابر آفات و بیماری­ها، کاهش ذخیره مواد غذایی کندو و در نهایت منجر به ضعیف شدن و کاهش سلامت کلنی­های زنبورعسل شده است  (DeGrandi-Hoffman et al., 2008; Ahmadi, 2014; Tosi et al., 2017). بنابراین، تغذیه مناسب برای رشدونموی زنبورها، سلامت و بقای کلنی­های زنبورعسل بسیار حیاتی است (Brodschneider & Crailsheim, 2010; Avni et al., 2014; Kalateh et al., 2025). مطالعات نشان داده است حتی گاهی گرده گل همه نیازهای کلنی را در زمان وفور گل در طبیعت به علت کمبودهای تغذیه­ای تامین نمی­کند (DeGrandi-Hoffman et al., 2016, 2018). بنابراین، نیاز به تغذیه تکمیلی برای غلبه بر دوره­های کمبود شهد و گرده در طبیعت و حمایت از توسعه کلنی در شرایط استرس­زا ضروری به نظر می­رسد.

کومبوچا (Kombucha)، یک نوشیدنی غیر الکی است که از تخمیر چای شیرین از طریق همزیستی باکتری­ها و مخمرها به­دست می­آید و به خاطر داشتن ترکیبات خاص پروتئینی، ویتامینی، اسیدهای چرب، اسیدهای آمینه، مواد معدنی، ترکیبات پلی­فنولیک و خواص سودمندش از قبیل فعالیت­های ضدمیکروبی، ضد ویروسی و خواص آنتی اکسیدانی و آنتی بیوتیکی خاص، برقراری تعادل در جمعیت فلور میکروبی دستگاه گوارش و جدیداً دارای خواص پروبیوتیکی به عنوان یک مکمل تغذیه­ای ارزشمند در طیف وسیعی از موجودات استفاده شده و نتایج فرآسودمند آن تایید شده است (Kumari et al., 2011; De Vadder et al., 2014; Ghosh et al., 2016; Saha et al., 2016; Chakravorty et al., 2019; Sengun & Kirmizigul, 2020).  این نوشیدنی ارزشمند در جیره غذایی دام و طیور استفاده شده و باعث بهبود وضعیت سلامت و افزایش عملکرد آنها شده است و اخیراً، به عنوان یک پروبیوتیک و خوراک عملکردی ارزشمند در جیره غذایی دام و طیور استفاده و گزارش شده که بر عملکرد دستگاه گوارش آنها تأثیر مثبت داشته و جمعیت میکروبی دستگاه گوارش را متعادل و عملکرد روده را بهبود بخشیده است (Adriani et al., 2011; Kabiri et al., 2014; Sengun & Kirmizigul, 2020; Salehi et al., 2023). پژوهشگران معتقدند که شربت کومبوچا به خاطر خواص و ترکیبات مفید و ارزشمندش، یک مکمل غذایی کامل به­حساب می­آید و به­خاطر داشتن خواص آنتی اکسیدانی، ضدباکتریایی، ضد ویروسی و pH اسیدی می­تواند در درمان بسیاری از میکروب­های بیماری­زا در بدن موجودات زنده از جمله زنبورعسل موثر باشد (Feizabadi et al., 2020; Salehi et al., 2023). مطالعات نشان داده که تغذیه کلنی­ها با شربت شکر حاوی مواد اسیدی کننده کمک زیادی در کاهش pH دستگاه هاضمه زنبورها کرده و مانع رشد و توسعه میکروب­های بیماری­زا در دستگاه گوارش آنها می­شود. تأثیرات ضد میکروبی مواد اسیدی کننده روی باکتری Paenibacillus larvae که عامل بیماری لوک آمریکایی است، نشان داده که استفاده از مواد اسیدی می­تواند روش جایگزین مناسبی برای کنترل این بیماری باشد (Fuselli et al., 2012). از این رو، ترکیباتی که تامین کننده مواد ضد میکروبی هستند، می­توانند نقش آنتی بیوتیک و پروبیوتیک را در زنبورعسل برعهده داشته و از توسعه بیماری­های مهمی از جمله بیماری نوزما در زنبورها جلوگیری نمایند.

کومبوچا حاوی ترکیبات پلی فنولیک و اسیدهای ارگانیک زیادی از جمله اسید استیک، اسید گلوکورونیک، اسید لاکتیک، اسید کربنیک، اسید فولیک، اسید اگزالیک، اسید مالیک، اسید بوتیریک، اسید نوکلئیک، آسکوربیک، اسـیـد پروپیونیک، اسید سوکسینیک و اسید سیتریک می­باشد که وجود این ترکیبات پلی فنولیک و اسیدهای ارگانیک باعث ایجاد خواص مهمی از جمله خواص آنتی اکسیدانی، ضدباکتریایی، بهبود اکسیداسیون متابولیسمی، تقویت سیستم ایمنی، اثرات ضد سرطانی، خواص آنتی بیوتیکی علیه باکتری­ها، ویروس­ها و مخمرها، تحریک سیستم غده­ای بدن، کاهش استرس و اضطراب و خاصیت سم زدایی در کومبوچا می­شوند (Dufresne et al., 2000; Brodschneider et al., 2009; Hodgson, 2011; Jayabalan et al., 2010; Rahimi & Salehi, 2025). همچنین، در کومبوچا ترکیبات مهم دیگری از قیبل پروتئین­ها، اسید آمینه­های ضروری (مثل ایزولوسین، لوسین، لیزین، متیونین، فنیل آلانین، ترئونین، وآلین وتریپتوفان)، اسید آمینه­های غیر ضروری (مثل آلانین، آرژنین، اسید اسپارتیک، سیستئین، اسید گلوتامیک، گلاسین، هیستیدین، پرولین، سرین و تیروزین)، ویتامین­های محلول در آب مثل ویتامین B1، B2، B3، B6، B12  و ویتامین C و مواد معدنی ضروری مثل سدیم، پتاسیم، فسفر، کلسیم، کلر، مس، آهن، منگنز، نیکل، سولفور و روی و قندهای ساده (مثل گلوکز و فروکتوز) وجود دارد که برای موجودات زنده از جمله زنبورعسل ضروری هستند (Rahimi & Salehi, 2025).

مطالعات بسیار محدودی روی اثر استفاده از کومبوچا روی زنبورعسل در ایران و دنیا انجام شده است. در یک پژوهشی، اثرات سطوح مختلف کومبوچا روی صفات عملکردی کلنی­های زنبورعسل (Apis mellifera) در استان آذربایجان غربی بررسی شد. نتایج این پژوهش نشان داد که کومبوچا روی صفات عملکردی و درصد پروتئین و چربی لاشه زنبورها به طور معنی­داری (01/0< p) موثر است. پس از اجرای این پژوهش، مصرف کومبوچا پنج درصد در لیتر به صورت محلول در شربت شکر برای افزایش صفات عملکردی و تولیدمثلی کلنی­های زنبورعسل پیشنهاد شد (Rajabi, 2025). در مطالعه دیگری، محققان مصرف مکمل آب ماست و توده قارچی کومبوچا در جیره پروتئینی زنبورعسل و تأثیر آن بر تخمریزی ملکه و وزن بدن زنبورهای کارگر را مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که مصرف مکمل آب ماست و توده قارچی کامبوچا در جیره پروتیئنی زنبورها به طور معنی­داری (01/0< p) باعث افزایش جمعیت نوزادان و وزن زنبورهای کارگر نسبت به تیمار شاهد شد ولی تفاوت معنی­داری از لحاظ تولید عسل در بین تیمارها مشاهده نشد. نتایج حاصل از این آزمایش نشان دهنده این امر است که مکمل کردن آب ماست و توده قارچی کومبوچا می­تواند جهت افزایش توان تخمریزی ملکه و همچنین افزایش سلامت کلنی­های زنبورعسل مورد استفاده قرار گیرد (Esmailzadeh et al., 2015). در بررسی دیگری، پژوهشگران گرده جمع آوری شده توسط زنبورهای عسل را با هدف بهبود وضعیت تغذیه آن به وسیله قارچ کومبوچا تخمیر و نتایج آن را مورد بررسی قرار دادند. نتایج مطالعه این محققان نشان داد که خواص و مزایای سلامتی مربوط به دانه­های گرده هنگام تخمیر آن به وسیله قارچ کومبوچا افزایش یافت (Utoiu et al., 2018).

بررسی­ها نشان داده است دسترسی زنبورهای عسل به گرده گل به عنوان منبع اصلی تأمین کننده پروتیئن­ها، ویتامین­ها، اسیدهای چرب و مواد معدنی در کلنی ضروری است. اگر زنبورهای کارگر جوان مواد پروتیئنی، ویتامینی، اسیدهای چرب و مواد معدنی را مصرف نکنند بیشتر فعالیت­های حیاتی آنها از جمله تولید ژل رویال، تولید موم، تولید زهر، توان زمستانگذرانی آنها، فعالیت چراگری و خیلی از ارگان­های حیاتی بدن آنها دچار اختلال می­شود (De Groot, 1952; Saffari et al., 2010; Corby-Harris & Snyder, 2018; Dolezal & Toth, 2018). با توجه به اثرات مفید و تایید شده کومبوچا روی موجودات مختلف به­خصوص در جیره­های غذایی دام و طیور، غنی بودن آن از لحاظ پروتئین­ها، ویتامین­ها، اسیدهای چرب آلی و مواد معدنی و همچنین مطالعه خیلی محدود تأثیر کومبوچا روی زنبورعسل به­خصوص تأثیر آن روی صفات عملکردی، تولیدمثلی و سایر خصوصیات کلنی­های زنبورعسل در ایران و جهان و جدید بودن موضوع در صنعت زنبورعسل، مطالعه حاضر با هدف بررسی تأثیر افزودن غلظت­های 5، 10 و 15 درصد در لیتر کومبوچا در شربت شکر روی غدد موم­ساز، غدد هیپوفارنژل، تولید زهر و توان زمستانگذرانی زنبورها و تحلیل اقتصادی آن بر عملکرد کلنی­های زنبورعسل در شرایط اقلیمی استان کردستان انجام شد.

مواد و روش­ها

زمان و مکان اجرای آزمایش. مطالعه حاضر با هدف بررسی تأثیر افزودن غلظت­های مختلف کومبوچا در شربت شکر روی غدد موم ساز، غدد هیپوفارنژل، تولید زهر و توان زمستانگذرانی زنبورها و تحلیل اقتصادی آن بر عملکرد کلنی­های زنبورعسل در شرایط اقلیمی استان کردستان طی بازه­ی زمانی 1402 الی 1404 انجام شد.

روش و نحوی اجرای مطالعه. مطالعه حاضر روی کلنی­های زنبورعسل زنبورستان تحقیقاتی مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی کردستان واقع در ایستگاه­های تحقیقاتی گریزه و سارال این مرکز (جدول 1) در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تیمار و هفت تکرار به مرحله اجرا در آمد. تیمارها شامل تیمار شاهد، تیمارهای حاوی غلظت­های 5، 10 و 15 درصد در لیتر کومبوچا به صورت محلول در شربت شکر (به نسبت 1 به 1) بودند. در سال اول مطالعه (1402)، کلنی­های زنبورعسل (نژاد ایرانی) آزمایشی در زنبورستان تحقیقاتی مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی کردستان واقع در ایستگاه تحقیقاتی گریزه این مرکز تهیه (شکل 1) و سپس در اردیبهشت و خردادماه 1402 کلنی­های آزمایشی از لحاظ سن ملکه (همگی دارای ملکه­های هم­سن خواهری)، جمعیت بالغین و نوزادان و مجدد در شهریور ماه 1402 نیز از لحاظ جمعیت (بالغین و نوزادان) و ذخیره عسل براساس دستورالعمل Delaplane et al. (2013) یکسان­سازی شدند. برای تولید کومبوچا برپایه چای خشک (جنس ایرانی) از دستورالعمل Jayabalan et al. (2010) با اندکی تغییرات مطابق مواد ارائه شده در جدول (2) در آزمایشگاه علوم دامی مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی کردستان استفاده شد. لازم به ذکر است pH کومبوچای رسیده در حین برداشتن قارچ کومبوچا از داخل آن (روز 12­ام) و هنگام استفاده آن در کلنی­ها اندازه گیری شد و 5/3 بود. در اسفند ماه سال 1402، کلنی­های آزمایشی برای حصول  اطمینان از زمستانگذرانی موفق آنها مورد بازدید قرار گرفتند. بعد از همسان­سازی مجدد کلنی­های آزمایشی از لحاظ جمعیت، از 15 فروردین 1403 کلنی­های آزمایشی با سطوح 5، 10 و 15 درصد در لیتر کومبوچا به صورت محلول در شربت شکر (به نسبت 1 به 1) به میزان 5/0 لیتر به صورت یک روز در میان طی دوره­ای به مدت 60 روز تغذیه شدند. این کار بعد از برداشت عسل و شروع فصل نرکشی در منطقه نیز انجام شد. در تیمار شاهد از شربت آب و شکر (به نسبت 1 به 1) استفاده شد. در مطالعه حاضر، صفاتی نظیر اندازه غدد هیپوفارنژل، اندازه غدد موم ساز، تولید زهر، توان زمستانگذرانی، تولید عسل و جمع آوری گرده کلنی­های زنبورعسل تیمارهای آزمایشی در بازه زمانی ذکر شده به شرح ذیل مورد اندازه گیری قرار گرفت.

جدول1- مختصات جغرافیایی، دما و بارش سالیانه ایستگاه­های تحقیقاتی در مطالعه حاضر

Table1- Geographical coordinates, annual rainfall and average temperature of research stations in the present study

جدول 2: مواد لازم برای تولید کومبوچا در مطالعه حاضر (برای حجم 10 لیتر کامبوچا)

Table 2: Materials required for kombucha production in the present study (for a volume of 10 liters of kombucha)

شکل 1- کلنی­های زنبورعسل مورد مطالعه در پژوهش حاضر

Fig. 1. Honey bee colonies studied in the present study

ارزیابی صفات مورد مطالعه

تولید عسل. برای ارزیابی مقدار عسل تولیدی کلنی­ها در فصل برداشت عسل در منطقه، وزن عسل برداشتی و باقی­مانده در هر کندو محاسبه شد. تفاوت وزن قاب­های عسل هر کندو قبل و بعد از استخراج عسل، میزان عسل تولیدی قاب­ها و مجموع عسل استخراج شده از قاب­های هر کلنی، میزان عسل تولیدی آن کلنی را تشکیل داد. برای ارزیابی وزن دقیق عسل باقی­مانده، از روش ارزیابی سطح عسل باقیمانده روی قاب­ها به وسیله قاب­ مخصوص که با سیم گالوانیزه به مسطیل­ 10×5 سانتی­متر کادربندی شده بود، استفاده شد. برای تخمین عسل باقی­مانده با استفاده از تجربیات محققین ایرانی (Yarahmadi et al., 2007) و دیگر کشورها از روش تبدیل سطح به وزن، بدین ترتیب هر دسی­متر مربع عسل در دو طرف قاب را معادل 304 گرم عسل در نظر گرفته، استفاده شد. با قرار دادن این قاب سیم کشی شده روی هر دو طرف قاب­های باقی­مانده عسل در کندوها، مجموعاً سطح عسل باقی­مانده در هر کلنی محاسبه و ثبت گردید. در پایان با مجموع عسل باقی­مانده و برداشتی، کل عسل تولیدی هر کندو به­دست آمده و برای آن کندو ثبت شد. ارزیابی این صفت روی تمام کلنی­های مورد مطالعه در فصل برداشت عسل در منطقه در تابستان 1403 انجام شد (Rahimi et al., 2023).

جمع آوری گرده. اندازه­گیری سطح گرده ذخیره شده براساس دستورالعمل Salehipor et al. (2024) انجام شد. بدین ترتیب، طول و عرض یک قاب خالی به اندازه­های 2 سانتی­متری درج و سپس به وسیله سیم گالوانیزه کادر بندی شد (شکل 2). شبکه­های مربع به­دست آمده مساحتی برابر با 4 سانتی­متر داشت. با منطبق نمودن کادر تقسیم بندی شده بر روی تک تک شان­های کلنی­ها و شمارش تعداد شبکه­های مربع پر از گرده، سطح گرده ذخیره شده کلنی­ها ارزیابی شد. ارزیابی این صفت در ماه­های اردیبهشت- خرداد سال 1403هر هفته یک بار به تعداد چهار بار روی کلنی­های مورد مطالعه انجام شد.

توان زمستانگذرانی. برای ارزیابی توان زمستانگذرانی، میزان جمعیت بالغین و ذخیره عسل تک تک کندوهای مورد مطالعه در دو نوبت مورد ارزیابی قرار گرفت. ارزیابی نوبت اول در اواسط پاییز 1403 هنگام آماده سازی کلنی­ها برای زمستانگذرانی و ارزیابی نوبت دوم در اوایل بهار 1404 هنگام شروع فعالیت کلنی­ها انجام شد. پس از ارزیابی جمعیت و ذخیره عسل در پاییز (1403) و بهار سال بعد (1404)، از ذخیره عسل آن کندو در بهار نسبت به پاییز و جمعیت بهار نسبت به پاییز آن کندو نسبت گرفته و سپس میانگین آنها به عنوان توان زمستانگذرانی آن کلنی ثبت شد و همین ارزیابی برای تمام کلنی­های زنبورعسل مورد مطالعه انجام شد (Rahimi et al., 2023).

شکل 2- ارزیابی سطح گرده ذخیره شده کلنی­های زنبورعسل مورد مطالعه

Fig.2. Evaluation of stored pollen surface in the studied honey bee colonies

اندازه غدد هیپوفارنژل. برای اندازه­گیری غدد هیپوفارنژل در خرداد ماه سال 1403، از هر کلنی در تیمارهای آزمایشی پنج زنبور پرستار جوان ترجیحاً از روی قاب­های حاوی لارو یک الی دو روزه برداشته و آنها را به داخل فالکون­های 50 میلی لیتری حاوی اتانول 96 درجه منتقل و سپس به آزمایشگاه انتقال داده­شدند. در آزمایشگاه زنبورها را به مدت سه دقیقه در دمای 20 – درجه سانتی­گراد نگه داشته تا کاملاً بی حرکت شوند. برای تشریح غدد شیری از روشSuenami et al. (2018)  با اندکی تغییرات استفاده شد. به منظور ایجاد بستری برای تشریح، مقداری پارافین جامد ذوب شده در یک ظرف پتری شیشه­ای بزرگ ( قطر دهانه 100 میلی­متر و ارتفاع 15 میلی­متر) ریخته، سپس ظرف پتری را در محیط آزمایشگاه قرار داده تا پارافین کاملاً به حالت جامد درآید. برای تشریح زنبورها، با کمک استریومیکروسکوپ Olympus و با استفاده از یک قیچی نوک تیز سر زنبور را از بدن جدا کرده و روی بستر تشریح طوری قرار گرفت به نحوی که قسمت جلویی آن (صورت زنبور) رو به بالا قرار گیرد. با فرو بردن یک سوزن نازک به هر یک از چشم­های مرکب و یک سوزن به داخل حفره دهانی، سر زنبور روی بستر پارافینی تثبیت شد. شاخک­های زنبور را با یک قیچی نوک تیز از قاعده قطع کرده و جلد سر با استفاده از یک تیغ نوک تیز و با ایجاد دو برش طولی در امتداد لبه داخلی چشم­های مرکب، یک برش عرضی در قسمت بالای قطعات دهانی و یک برش عرضی دیگر در قسمت فرق سر شکافته شد. سپس، 30 میکرولیتر بافر فسفات (کلرید سدیم 137 میلی­مولار، کلرید پتاسیم 7/2 میلی مولار، دی­سدیم فسفات 10 میلی­مولار و مونو پتاسیم فسفات 8/1میلی­مولار) روی قسمت شکافته شده سر زنبور ریخته تا غدد شیری به صورت شناور درآیند. این غدد را با استفاده از یک پنس نوک تیز به آرامی برداشته و پس از توزین، مطابق روش Corby-Harris و Snyder (2018) با اعمال تغییرات جزیی رنگ­آمیزی شدند. بدین منظور، ابتدا محلول رنگی گیمسا (6/0 گرم پودر گیمسا، 50 میلی­لیتر متانول و 50 میلی­لیتر گلیسرول) تهیه شد. این محلول با نسبت 1:10 با بافر فسفات (یک قسمت محلول رنگی گیمسا به نه قسمت بافر فسفات) رقیق شده و سپس 20  میکرولیتر از محلول رنگی رقیق شده روی یک قسمت از لام ریخته شد. غدد شیری را با کمک یک پنس نوک تیز به آرامی به محلول رنگی منتقل و به مدت پنج دقیقه نگهداری شد. 50 میکرولیتر بافر فسفات را روی قسمت دیگری از لام ریخته و غدد رنگ­آمیزی شده به آرامی به آن منتقل شد تا رنگ اضافی شسته شود. در صورت نیاز، غدد شیری با کمک تیغ تیز به تکه­های کوچکتر تقسیم شد. نمونه­های رنگ آمیزی­شده با میکروسکوپ نوری Olympus مورد بررسی قرار گرفت. به ازای هر زنبور، طول و عرض حداقل 20 آسینی به طور تصادفی، اندازه گیری و میانگین اندازه آسینی­های هر زنبور و به همین ترتیب میانگین اندازه آسینی­های زنبورهای مربوط به هر تکرار و تیمار به عنوان اندازه غدد هیپوفارنژل آن تکرار و تیمار محاسبه شد.

اندازه غدد موم ساز. برای اندازه­گیری غدد موم ساز، در اول خرداد 1403 در داخل هر کندو در تیمارهای آزمایشی یک قاب را علامت­دار کرده و زمان تخمریزی ملکه در آن قاب ثبت شد. سپس، یک روز قبل از تولد زنبورها، آن قاب را به آزمایشگاه منتقل و 20 زنبور کارگر تازه متولد شده را علامت گذاری و سپس زنبورها به داخل کلنی مادری برگردانده شدند. در سن 13 روزگی زنبورها، از هر کلنی هفت زنبور علامت­دار را برداشته و آنها را به داخل فالکون­های 50 میلی لیتری حاوی محلول پامپل منتقل و سپس نمونه­ها به آزمایشگاه انتقال داده شدند. در آزمایشگاه زنبورها را به مدت سه دقیقه در دمای 20 – درجه سانتی­گراد نگه داشته تا کاملاً بی حرکت شوند. برای اندازه گیری غدد موم ساز از دستورالعمل(1976) Sanford and Dietz استفاده شد. بدین ترتیب، با ایجاد یک مقطع عرضی بند پنجم شکمی زنبورها را برداشته و سپس با کمک پنس و قیچی مخصوص در زیر بینوکولار مدرج آیینه­های مومی و لایه پشتی آن که حاوی بافت اپیتلیال که به آن غدد مومی نیز می گویند، برداشته شد. ارتفاع بافت اپیتلیال به عنوان اندازه غدد موم ساز در نظر گرفته شد. براساس مطالعات انجام شده، ماکزیمم ارتفاع این بافت مربوط به سن 13 روزگی زنبورهای کارگر است و اندازه آن در سایر بندهای حاوی غدد موم ساز یکسان است (Justino et al. (2018)). بدین منظور، در پنج نقطه در طول این بافت ارتفاع آن ثبت شده و میانگین آن به عنوان اندازه غدد موم ساز آن زنبور ثبت  شد. همین اندازه­گیری برای سایر زنبورهای آن کندو انجام و میانگین آن به عنوان اندازه غدد موم ساز آن کلنی ثبت و همین اندازه گیری برای زنبورهای مابقی کندوهای آن تیمار و سایر تیمارهای آزمایشی انجام شد.

تولید زهر. برای اندازه­گیری تولید زهر زنبورهای کلنی­های زنبورعسل تیمارهای آزمایشی از دستگاه زهر گیری داخل کندو در مطالعه حاضر استفاده شد. این دستگاه از دو قسمت شــوک دهنده و قاب جمع­آوری زهر و متعلقات آن تشــکیل شــده اســت. دســتگاه شــوک دهنــده استفاده شده دارای یک ترانس کاهنده اســت که ولتــاژ ۲۲۰ ولت را به ۲۳ ولت تبدیــل می­کند. قاب جمع­آوری زهر نیز از یک قــاب چوبی به ابعاد ۵/۱×۳۰×۴۰ ســانتی متر ســاخته شده که روی آن ســیم­هایی به ضخامــت ۶/۰ میلــی متر بــه فاصله ۷-۵ میلی مترکشــیده شــده است. در زیر ســیم­ها هم یک صفحه شیشه­ای به ابعاد ۳۲×۲۳ سانتی­متر قرار دارد. برای زهرگیری با این دســتگاه، قاب جمع­آوری زهر روی قسمت فوقانــی شــان­ها در زیر درب کندو قرار داده شد، ســپس درب کندو را گذاشــته و دستگاه روشــن و پس از 15 دقیقه شوک دادن دستگاه بصــورت خودکار خاموش شد. در طی این 15 دقیقه، دستگاه به طور اتوماتیک 3 ثانیه روشن (شوک دهی) و سپس 10 ثانیه غیر فعال می­شد (به عنوان زمان استراحت). بعد از طی 15 دقیقه، دســتگاه را از داخل کندو خارج کرده و زهر اســتحصال شــده را در آزمایشــگاه از روی صفحه شیشــه­ای تراشــیده و در شیشــه­های کوچک درب دار جمع­آوری، توزین و نگهداری شد. ارزیابی این صفت روی تیمارهای آزمایشی هر دو هفته یکبار و مجموعاً دو بار از تاریخ 20 خرداد تا 20 مرداد سال 1403 با توجه به توصیه­های سازنده دستگاه روی تمام کلنی­های آزمایشی انجام شد. زهرگیری از تمام کلنی­های آزمایشی در هر دفعه زهرگیری در همان روز انجام گردید.

تحلیل اقتصادی. هزینه­ها و درآمدها در طول اجرای مطالعه ثبت شد. هزینه­ها به دو دسته شامل هزینه تغذیه و سایر هزینه­ها تقسیم شدند. هزینه تغذیه با شربت کومبوچا از ابتدا تا پایان آزمایش ثبت شد و سایر هزینه­ها (هزینه شکر، کارگری، برگه موم آجدار، پوکه یا شانه مومی، مهاجرت کلنی­ها و داورهای مصرفی) معادل 35 درصد کل هزینه­ها در نظر گرفته شد (Talebi et al., 2010). درآمد حاصل از فروش عسل و گرده در پایان آزمایش به عنوان درآمد درنظر گرفته شد. با کسر میزان هزینه­ها از مجموع درآمد حاصل از فروش عسل و گرده، سود ناخالص به ازای هر کندو در هر تیمار آزمایشی محاسبه شد.

آنالیز داده­ها. نرمال بودن توزیع داده­ها در مطالعه حاضر به­وسیله آزمون کلوموگروف اسمیرنوف با استفاده از رویه univariate نرم افزار آماری SAS 9.4 M6  مورد آزمون قرار گرفت. پس از حصول اطمینان از نرمال بودن توزیع داده­ها، تجزیه واریانس داده­های مطالعه حاضر با استفاده از رویه GLM تعبیه شده در نرم افزار SAS V.9.4 و مقایسه میانگین­های تیمارهای آزمایشی هم با استفاده از آزمون توکی با استفاده از همین نرم افزار انجام شد.

مدل آماری زیر برای تجزیه و تحلیل داده­های به­دست آمده در مطالعه حاضر مورد استفاده قرار گرفت:

                                                                yij = µ + hij + tj + ɛij

yij = هر مشاهده از هر واحد آزمایشی                        µ = میانگین جامعه                     hij= اثر تصادفی کندو در آزمایش

tj= اثر ثابت تیمار                                                ɛij = اثر خطای آزمایش

نتایج

تجزیه واریانس و مقایسه میانگین­ها. نتایج تجزیه واریانس تأثیر افزودن غلظت­های 5، 10 و 15 درصد در لیتر کومبوچا در شربت شکر روی صفات مورد مطالعه در جدول (3) ارائه شده است. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که تأثیر افزودن غلظت­های 5، 10 و 15 درصد در لیتر کومبوچا در شربت شکر روی غدد موم ساز، غدد هیپوفارنژل، تولید زهر و توان زمستانگذرانی کلنی­های زنبورعسل مورد مطالعه معنی­دار بود (01/0< p). نتایج مقایسه میانگین­های­ تأثیر افزودن غلظت­های 5، 10 و 15 درصد در لیتر کومبوچا  در شربت شکر روی رشد غدد موم ساز، غدد هیپوفارنژل، تولید زهر و توان زمستانگذرانی کلنی­های زنبورعسل مورد مطالعه در جدول (4) ارائه شده است. نتایج مقایسه میانگین­های اندازه غدد موم ساز زنبورهای عسل تیمارهای آزمایشی نشان داد بیشترین میانگین اندازه غدد موم ساز با میانگین 86/1142 میکرون با اختلاف معنی­دار (01/0< p) نسبت به سایر تیمارها مربوط به زنبورهای کلنی­های عسل تیمار کومبوچای  10 درصد در لیتر و کمترین این صفت با میانگین 57/828 میکرون مربوط به زنبورهای کلنی­های زنبورعسل تیمار شاهد بود. نتایج مقایسه میانگین­های اندازه غدد هیپوفارنژل زنبورهای کلنی­های زنبورعسل تیمارهای مورد مطالعه نشان داد بیشترین میانگین طول این غدد با میانگین  08/153 میکرون با اختلاف معنی­دار (01/0< p) نسبت به سایر تیمارها مربوط به زنبورهای کلنی­های زنبورعسل تیمار کومبوچای 10 درصد در لیتر و کمترین طول این غدد با میانگین 14/93 میکرون مربوط به زنبورهای کلنی­های زنبورعسل تیمار شاهد بود. همچنین، براساس نتایج مقایسه میانگین­های به­دست آمده، بیشترین عرض غدد هیپوفارنژل با میانگین 92/93 میکرون با اختلاف معنی­دار (01/0< p) نسبت به سایر تیمارهای مورد مطالعه مربوط به زنبورهای کلنی­های زنبورعسل تیمار کومبوچای 10 درصد در لتیر و کمترین عرض این غدد با میانگین 77/65 میکرون مربوط به زنبورهای کلنی­های زنبورعسل تیمار شاهد بود. نتایج مقایسه میانگین­های­ صفت تولید زهر نشان داد بیشترین میانگین صفت تولیدزهر با میانگین 14/0 گرم با اختلاف معنی­دار (01/0< p) نسبت به سایر تیمارها مربوط به زنبورهای کلنی­های زنبورعسل تیمار کومبوچای 10 درصد در لتیر و کمترین آن با میانگین 08/0 گرم مربوط به زنبورهای کلنی­های زنبورعسل تیمار شاهد بود. براساس نتایج به دست آمده، بیشترین میانگین توان زمستانگذرانی کلنی­های زنبورعسل مورد مطالعه با میانگین 62/0 با اختلاف معنی­دار (01/0< p) نسبت به سایر تیمارها مربوط به کلنی­های زنبورعسل تیمار کومبوچای 10 درصد در لیتر و کمترین میانگین این صفت با میانگین 43/0 مربوط به کلنی­های زنبورعسل تیمار شاهد بود.

تحلیل اقتصادی. در مطالعه حاضر تحلیل اقتصادی اثر افزودن کومبوچا در تغذیه زنبورها بر عملکرد کلنی­های زنبورعسل تیماری آزمایشی براساس دو فرآورده مهم مورد نظر زنبورداران ایرانی از لحاظ تولید (صفات تولیدعسل و جمع آوری گرده) انجام و نتایج آن در جدول (5) ارائه شده است. مقایسه تحلیل اقتصادی اثر افزودن غلظت­های مختلف کومبوچا  به صورت محلول در شربت شکر در تغذیه زنبورهای تیمارهای آزمایشی نشان داد افزودن کومبوچا در تغذیه زنبورها منجر به افزایش سود حاصل از فروش فرآورده­های هر کلنی (عسل و گرده) در مقایسه با تیمار شاهد شد. نتایج به­دست آمده نشان داد بیشترین سود حاصل از افزودن کومبوچا در تغذیه زنبورهای تیمارهای آزمایشی مربوط به تیمار کومبوچای 10 درصد در لیتر بود که این تیمار با بالاترین مقدار سود (103157500 ریال) به ازای هر کندو و 52747010 ریال سود در مقایسه با تیمار شاهد به عنوان بهترین تیمار شناخته شد.

جدول 3- نتایج تجزیه واریانس تأثیر افزودن کومبوچا در شربت شکر روی غدد موم ساز، غدد هیپوفارنژل، تولید زهر و توان زمستانگذرانی کلنی­های زنبورعسل مورد مطالعه

Table 3. Variance analysis results of the effect of adding kombucha to sugar syrup on wax glands, hypopharyngeal glands, venom production, and overwintering performance of the studied honey bee colonies

**:   Significance level of one percent, *: significance level of five percent, n.s: not significant

The number for each trait represents the mean of squares      

جدول 4- نتایج مقایسه میانگین­های­ تأثیر افزودن کومبوچا در شربت شکر روی غدد موم ساز، غدد هیپوفارنژل، تولید زهر و توان زمستانگذرانی زنبورهای عسل مورد مطالعه براساس روش توکی در سطح احتمال یک درصد

Table 4. Mean comparison results of the effect of adding kombucha to sugar syrup on wax glands, hypopharyngeal glands, venom production, and overwintering performance of the studied honey bee colonies based on the Tukey method at a probability level of one percent

جدول 5- تحلیل اقتصادی افزدون کومبوچا در تغذیه کلنی­های زنبورعسل تیمارهای آزمایشی در مطالعه حاضر

Table 5. Economic analysis of adding kombucha to the diet of honey bee colonies in the experimental treatments of the present study

*- Economic evaluation was calculated based on two traits: honey and pollen production in the present study.

**- Prices are based on the September 2024 rate, and prices and costs are in Rials.

*** - Calculations were performed per colony at the end of the experiment

بحث و نتیجه گیری

کومبوچا، یک نوشیدنی غیر الکی است که از تخمیر چای شیرین از طریق همزیستی باکتری­ها و مخمرها به­دست می­آید و به خاطر داشتن ترکیبات و خواص سودمندش به عنوان یک مکمل تغذیه­ای ارزشمند در طیف وسیعی از موجودات زنده استفاده شده و نتایج فرآسودمند آن تایید شده است. پژوهش­های محدودی روی تأثیر کومبوچا بر صفات تولیدمثلی و عملکردی کلنی­های زنبورعسل انجام شده و موضوع جدیدی در مبحث تغذیه زنبورعسل است. به همین خاطر، مطالعه حاضر برای اولین بار با هدف بررسی تأثیر افزودن غلظت­های 5، 10 و 15 درصد در لیتر کومبوچا در شربت شکر روی غدد موم ساز، غدد هیپوفارنژل، تولید زهر و توان زمستانگذرانی کلنی­های زنبورعسل در شرایط اقلیمی استان کردستان انجام شد. نتایج مطالعه حاضر نشان داد که افزودن کومبوچا به صورت محلول در شربت شکر در تغذیه زنبورها روی رشد غدد موم ساز، غدد هیپوفارنژل، تولید زهر و توان زمستانگذرانی کلنی­های زنبورعسل مورد مطالعه موثر و بیشترین تأثیر مطلوب این مکمل با اختلاف معنی­دار (01/0< p) نسبت به سایر تیمارهای مورد مطالعه در پژوهش حاضر مربوط به تیمار کومبوچای 10 درصد در لیتر بود. بنابراین، با توجه به نتایج پژوهش حاضر مصرف غلظت 10 درصد در لیتر کومبوچا به عنوان غلظت بهینه این مکمل به صورت محلول در شربت شکر برای تغذیه کلنی­های زنبورعسل به­خصوص در مواقع کمبود شهد و گرده در طبیعت توصیه می­شود. کومبوچا سرشار از باکتری­های اسید لاکتیک، مخمرها، اسیدهای آلی، آنزیم­ها و مواد آنتی اکسیدانی، ویتامین­ها به­خصوص ویتامین­های گروه B، پلی فنول­ها، مواد ضد میکروبی و مقداری قند باقیمانده است که می­تواند به عنوان پروبیوتیک­ها و پری بیوتیک­ها در زنبورعسل عمل کند. تأثیر مطلوب و معنی­دار (01/0< p)  غلظت 10 درصد در لیتر کومبوچا روی صفات مورد مطالعه احتمالاً به این دلیل باشد که در این غلظت مقدار بهینه­ای از این میگروارگانیسم­ها برای زنبورها فراهم می­شود تا فلورمیکروبی روده آنها تقویت شده که این موضوع به جذب بهتر مواد مغذی و افزایش مقاومت زنبورها در برابر پاتوژن­ها کمک کند. همچنین، غلظت بهینه 10 درصد در لیتر کومبوچا ممکن است طعم دلپذیری (به دلیل اسیدیته و ترکیبات تخمیری) به شربت شکر بدهد که باعث شود زنبورها بیشتر شربت شکر را مصرف کنند و در نتیجه ضمن دریافت مواد پروتیئنی، ویتامینی، اسیدهای چرب و مواد معدنی (به­واسطه افزودن کومبوچا در شریت شکر)، انژری بیشتری برای فعالیت­های رفتاری و عملکردی (مانند تخمریزی ملکه و جمع آوری شهد و گرده) داشته باشند. با وجود اینکه صفاتی مثل خوشخوراکی شربت کومبوچا، رفتار تهاجمی، تعویض ملکه و غارت جزو صفات مورد مطالعه در زمان تصویب پروپوزال طرح تحقیقاتی نبود ولی در بررسی­های میدانی حین اجرای پروژه این صفات نیز مورد ارزیابی قرار گرفت. به­غیر از تیمار کومبوچای 15 درصد در لیتر بقیه تیمارها از لحاظ این صفات مشابه تیمار شاهد بودند ولی زنبورهای کلنی­های زنبورعسل تغذیه شده با کومبوچای 15 درصد در لیتر تهاجمی­تر و در برخی تکرارهای این تیمار غارت هم مشاهده شد. علیرغم این موارد، خوشخوارکی کومبوچای 15 درصد در لیتر نسبت به سایر غلظت­های مورد مطالعه این مکمل (5 و 10 درصد در لیتر) و همچنین تیمار شاهد کمتر بود (پس از 48 ساعت بیش از یک سوم شربت در ته ظرف تغذیه این تیمار باقی می­ماند). همچنین، در یکی از تکرارهای تیمار کومبوچای 15 درصد در لتیر، تعویض اضطراری ملکه نیز مشاهده شد. دلایل متعددی باعث می‌شود که غلظت‌های بالای کومبوچا برای زنبورهای عسل خوشایند نباشد و اثرات نامطلوبی بر آن‌ها بگذارد، از جمله: 1) کومبوچا حاوی اسیدهای مختلف، قندها و پروتئین‌ها است که در غلظت‌های بالا می‌توانند طعم و بافت شربت شکر را تغییر دهند و زنبورها به دلیل طعم تند یا ترش این ترکیبات از شربت شکر حاوی غلظت بالای کومبوچا (15 درصد در لیتر) اجتناب کنند، 2) کومبوچا ترکیبی از باکتری‌ها و مخمرها است که طی فرآیند تخمیر تولید می‌شوند. این میکروارگانیسم‌ها در غلظت‌های بالای کومبوچا ممکن است برای زنبورهای عسل غیرقابل هضم باشند و 3) اسیدهای آلی در غلظت­های بالا برای حشرات خاصیت دورکنندگی دارند. کومبوچا سرشار از اسیدهای آلی مانند مانند استیک، سیتریک و لاکتیک است که این اسیدها در غلظت­های بالا خواص دورکنندگی برای زنبورهای عسل دارند. نتایج تحلیل اقتصادی اثر افزودن کومبوچا در تغذیه زنبورها بر عملکرد کلنی­های زنبورعسل براساس صفات تولیدعسل و جمع­آوری گرده نیز نشان داد افزودن کومبوچا در تغذیه زنبورها منجر به افزایش سود حاصل از فروش فرآورده­های هر کلنی (عسل و گرده) در مقایسه با تیمار شاهد شد. براساس نتایج به­دست آمده، تیمار کومبوچا 10 درصد در لیتر با بالاترین مقدار سود (103157500 ریال) به ازای هر کندو و 52747010 ریال سود در مقایسه با تیمار شاهد به عنوان بهترین تیمار شناخته شد. بنابراین، با توجه به نتایج مطالعه حاضر می­توان تغذیه کلنی­های زنبورعسل را با کومبوچای 10 درصد در لیتر به صورت محلول در شربت شکر برای بهبود غدد موم ساز، غدد هیپوفارنژل، تولید زهر و توان زمستانگذرانی و همچنین افزایش بازده اقتصادی زنبورستان­ها توصیه کرد. در یک مطالعه­ای،Rajabi (2025)  تأثیر سطوح مختلف شربت کومبوچا بر پایه چای خشک را روی صفات عملکردی کلنی­های زنبورعسل (Apis mellifera) در شرایط اقلیمی استان آذربایجان غربی بررسی کرد. هم راستا با نتایج مطالعه حاضر این پژوهشگر گزارش کردند که تأثیر سطوح مختلف شربت کومبوچا روی صفات عملکردی و درصد پروتئین و چربی لاشه زنبورها به طور معنی­داری (01/0 < p) موثر بود. پس از اجرای این پژوهش، این محقق مصرف شربت کومبوچا به صورت پنج درصد در لیتر را برای افزایش صفات عملکردی و تولیدمثلی کلنی­های زنبورعسل پیشنهاد دادند. در مطالعه­ای دیگری،  Esmaeilzadeh et al. (2015) تأثیر مکمل آب ماست و توده قارچ کومبوچا در جیره پروتئینی زنبورعسل را بر تخمریزی ملکه و وزن بدن زنبورهای کارگر مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که مصرف مکمل آب ماست و توده قارچ کومبوچا در جیره پروتیئنی زنبورها به طور معنی­داری باعث افزایش جمعیت نوزادان و وزن زنبورهای کارگر نسبت به تیمار شاهد شد. این محققان گزارش کردند مکمل کردن آب ماست و توده قارچ کومبوچا در جیره پروتئینی زنبورها می­تواند جهت افزایش توان تخمریزی ملکه و همچنین افزایش سلامتی کلنی­­های زنبورعسل مورد استفاده قرار گیرد. در بررسی دیگری در سال (2009)، محققی به اسم Wrangler به مدت سه هفته شربت کومبوچا رفیق شده را به صورت اسپری روی زنبورها استفاده و همسو با نتایج مطالعه حاضر گزارش کردند که مصرف شربت کومبوچا باعث بهبود صفات رفتاری و عملکردی زنبورها از جمله صفات تولید عسل و رفتار تهاجمی زنبورها می­شود. همچنین، این محقق گزارش کردند که مصرف کومبوچای رقیق شده به صورت اسپری روی زنبورها خیلی بهتر از دود زنبورها را آرام می­کند. مطالعات نشان داده است تغذیه کلنی­ها با شربت شکر حاوی مواد اسیدی کمک زیادی در کاهش pH  دستگاه هاضمه زنبورها کرده و مانع رشد و توسعه میکروب­های بیماری­زا در بدن زنبورها می­شود. همچنین، تأثیرات ضد میکروبی مواد اسیدی روی باکتری Paenibacillus larvae که عامل بیماری لوک آمریکایی در زنبورعسل است، اثبات شده است (Fuselli et al., 2012). با توجه به اینکه pH کومبوچا اسیدی (4/3=pH (کومبوچای برداشت شده در روز هفتم کشت)) است احتمالاً در درمان بسیاری مشکلات گوارشی و بیماری­های زنبورعسل از جمله بیماری لوک آمریکایی و نوزما موثر باشد. بنابراین توصیه می­شود در مطالعات آینده تأثیر آن روی کنترل و بهبود مشکلات گوارشی و بیماری زنبورعسل از جمله لوک آمریکایی و نوزما بررسی شود.

به طور کلی، یافته­های پژوهش حاضر نشان داد افزودن کومبوچا در تغذیه زنبورها روی رشد غدد موم ساز، غدد هیپوفارنژل، تولید زهر و توان زمستانگذرانی کلنی­های زنبورعسل مورد مطالعه به طور معنی­داری (01/0 < p) موثر بوده و بیشترین تأثیر مطلوب این مکمل نسبت به سایر تیمارهای آزمایشی مورد مطالعه در پژوهش حاضر مربوط به تیمار کومبوچای 10 درصد در لیتر بود. همچنین، تحلیل اقتصادی اثر غلظت­های مختلف کومبوچا بر عملکرد کلنی­های زنبورعسل تیمارهای آزمایشی نیز نشان داد افزودن کومبوچا در تغذیه زنبورها منجر به افزایش سود حاصل از فروش فرآورده­های هر کلنی (عسل و گرده) در مقایسه با تیمار شاهد شد. بیشترین سود حاصل از افزودن کومبوچا در تیمارهای آزمایشی مربوط به تیمار کومبوچای 10 درصد در لیتر بود که این تیمار با بالاترین مقدار سود (103157500 ریال) به ازای هر کندو و 52747010 ریالسود در مقایسه با تیمار شاهد به عنوان بهترین تیمار شناخته شد. بنابراین، با توجه به نتایج پژوهش حاضر می­توان تغذیه کلنی­ها با غلظت بهینه 10 درصد در لیتر کومبوچا به صورت محلول در شربت شکر برای بهبود صفات عملکردی کلنی­های زنبورعسل و افزایش بازده اقتصادی زنبورستان­ها به­خصوص در دوره­­های کمبود شهد و گرده در طبیعت پیشنهاد کرد.

Author's Contributions

Ataollah Rahimi: conceptualization, methodology, formal analysis, investigation, draft preparation, final review and edit, visualization, supervision, project administration and funding acquisition, Saleh Salehi: final review, edit and methodology.

 Author's Information

Funding

This research has received financial support by, Kurdistan Agricultural and Natural Resources Research and Education Center, Agricultural Research Education and Extension Organization (AREEO), Sanandaj, Iran

Data Availability Statement

All data supporting the findings of this study are available within the paper.

 Acknowledgments

The authors are extremely grateful to Dr. Vahid Mahdavi and Dr. Hamid Reza Bahmani for the scientific editing of this article.

Ethics Approval and Consent to Participate

Insects were used in this study. All applicable international, national, and institutional guidelines for the care and use of animals were followed. This article does not contain any studies with human participants performed by any of the authors.

Consent for Publication

not applicable

Conflict of Interest

The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this paper.

Generative AI statement

The authors declare that no Gen AI was used in the creation of this manuscript.