| تعداد نشریات | 282 |
| تعداد نشریات سازمان | 80 |
| تعداد شماره‌ها | 3,272 |
| تعداد مقالات | 36,149 |
| تعداد مشاهده مقاله | 55,721,603 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 94,498,475 |
Development and Optimization of a PCR–RFLP Method for Differentiation of Aspergillus flavus From Aspergillus parasiticus | ||
| Archives of Razi Institute | ||
| مقاله 21، دوره 81، شماره 1، فروردین و اردیبهشت 2026، صفحه 183-190 اصل مقاله (938.37 K) | ||
| نوع مقاله: Original Articles | ||
| شناسه دیجیتال (DOI): 10.66224/ARI.81.1.3821 | ||
| نویسندگان | ||
| Nooshin Sohrabi1؛ Morteza Taghizadeh* 2 | ||
| 1Department of Biology, PayameNoor University, Tehran, Iran. | ||
| 2Department of Medical Virology Razi Vaccine and Serum Research Institute, Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO),Karaj, Iran. | ||
| چکیده | ||
| Introduction: Aflatoxins are highly toxic secondary metabolites produced by several Aspergillus species, pose a global threat to food and feed safety, making rapid and reliable identification of aflatoxigenic species essential for effective surveillance and risk mitigation. Here, we report the development and validation a simple polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR–RFLP) assay that discriminates between the closely related species Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus by targeting conserved regions of the aflatoxin biosynthetic pathway for use in feed surveillance. Materials & Methods: A total of 42 fungal isolates from feed samples were identified as Aspergillus species and genomic DNA was extracted from the cultured mycelial biomass for further molecular analyses. The conserved primer sets to amplify three genes related to aflatoxin production pathway: aflD (nor-1), aflR, and aflP (omtA). The PCR products were digested with the restriction enzymes XbaI and XhoI and resolved them using 2% agarose gel. The RFLP patterns compared with the predicted digestion patterns from reference genomes to check their agreement and ability to provide accurate diagnosis. Results: Distinct RFLP patterns were obtained for A. flavus whereby for each of the three amplicons there were two diagnostic fragments (e.g. 321/139 bp for aflD). In contrast, the PCR products for A. parasiticus did not produce the same restriction sites, and no digestion was seen in this species. The assay consistently discriminated A. flavus from A. parasiticus. Conclusion: The recommended PCR–RFLP assay can be a rapid and cost-effective technique for identifying A. flavus from A. parasiticus in feed samples. However, using only this enzyme selection does not discriminate all clinically or agriculturally pertinent genera of Aspergillus. We recommend using this assay with added and new restriction enzymes, or coupling with other molecular analysis in order to allow for complete species discrimination. Ultimately, the performance should be validated with a variety of field isolates before using it as a standard diagnostic method. | ||
| کلیدواژه‌ها | ||
| Aspergillus flavus؛ Aspergillus parasiticus؛ Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)؛ aflD؛ aflR؛ aflP | ||
| عنوان مقاله [English] | ||
| طراحی و بهینه سازی روش PCR–RFLP برای شناسایی و تمایز Aspergillus flavus و Aspergillus parasiticus | ||
| چکیده [English] | ||
| آفلاتوکسین‌ها متابولیت‌های ثانویه‌ای با سمیت بسیار بالا هستند که توسط چندین گونه از جنس Aspergillus تولید می‌شوند و تهدیدی جهانی برای ایمنی مواد غذایی و خوراک دام به شمار می‌آیند؛ ازاین‌رو شناسایی سریع و قابل اعتماد گونه‌های آفلاتوکسین‌زا برای پایش مؤثر و کاهش خطر ضروری است. در این مطالعه، توسعه و اعتبارسنجی یک آزمون ساده PCR–RFLP گزارش می‌شود که با هدف قرار دادن نواحی محافظت‌شده مسیر بیوسنتز آفلاتوکسین، امکان تفکیک دو گونه نزدیک به هم Aspergillus flavus و Aspergillus parasiticus را برای کاربرد در پایش خوراک دام فراهم می‌کند. در مجموع، ۴۲ ایزوله قارچی از نمونه‌های خوراک دام به‌عنوان گونه‌های Aspergillus شناسایی شدند و DNA ژنومی از بیومس میسلیومی کشت‌شده برای انجام تحلیل‌های مولکولی استخراج شد. مجموعه پرایمرهای محافظت‌شده برای تکثیر سه ژن مرتبط با مسیر تولید آفلاتوکسین شامل aflD (nor-1)، aflR و aflP (omtA) مورد استفاده قرار گرفت. محصولات PCR با آنزیم‌های محدودکننده XbaI و XhoI هضم شده و قطعات حاصل بر روی ژل آگارز ۲٪ تفکیک شدند. الگوهای RFLP به‌دست‌آمده با الگوهای هضم پیش‌بینی‌شده از ژنوم‌های مرجع مقایسه شدند تا میزان تطابق و توان تشخیصی روش ارزیابی شود. الگوهای RFLP متمایزی برای A. flavus به‌دست آمد، به‌طوری که برای هر یک از سه آمپلیکون، دو قطعه تشخیصی مشخص مشاهده شد (برای مثال 321/139 جفت‌باز برای aflD). در مقابل، محصولات PCR مربوط به A. parasiticus فاقد جایگاه‌های برشی مشابه بودند و در این گونه هضمی مشاهده نشد. این آزمون به‌طور یکنواخت توانست A. flavus را از A. parasiticus تفکیک کند. آزمون PCR–RFLP پیشنهادی می‌تواند به‌عنوان روشی سریع و مقرون‌به‌صرفه برای شناسایی A. flavus از A. parasiticus در نمونه‌های خوراک دام مورد استفاده قرار گیرد. با این حال، استفاده از این مجموعه محدود آنزیمی به‌تنهایی قادر به تفکیک تمامی گونه‌های بالینی یا کشاورزی مهم جنس Aspergillus نیست. ازاین‌رو، توصیه می‌شود این آزمون با به‌کارگیری آنزیم‌های محدودکننده اضافی یا جدید و یا در ترکیب با سایر روش‌های مولکولی مورد استفاده قرار گیرد تا امکان تفکیک کامل گونه‌ها فراهم شود. در نهایت، پیش از به‌کارگیری این روش به‌عنوان یک آزمون تشخیصی استاندارد، لازم است عملکرد آن با مجموعه متنوعی از ایزوله‌های میدانی اعتبارسنجی شود. | ||
| کلیدواژه‌ها [English] | ||
| آسپرژیلوس, PCR-RFLP, aflD, aflR, aflP | ||
|
سایر فایل های مرتبط با مقاله
|
||
| مراجع | ||
|
Alshannaq A, Yu JH. Occurrence, toxicity, and analysis of major mycotoxins in food. Int J Environ Res Public Health. 2017; 14(6):632. [DOI:10.3390/ijerph14060632] [PMID]
Pasqualotto AC. Differences in pathogenicity and clinical syndromes due to Aspergillus fumigatus and Aspergillus flavus. Med Mycol. 2009; 47( Suppl 1):S261-70. [DOI:10.1080/13693780802247702] [PMID]
Lee HJ, Ryu D. Advances in mycotoxin research: Public health perspectives. J Food Sci. 2015; 80(12):T2970-83. [DOI:10.1111/1750-3841.13156]
Yu J. Current understanding on aflatoxin biosynthesis and future perspective in reducing aflatoxin contamination. Toxins (Basel). 2012; 4(11):1024-57. [DOI:10.3390/toxins4111024][PMID]
Stoloff L. Aflatoxin is not a probably human carcinogen: the published evidence is sufficient. Regul Toxicol Pharmacol. 1989; 10(3):272-83. [DOI:10.1016/0273-2300(89)90054-8] [PMID]
Umesha S, Manukumar HM, Chandrasekhar B, Shivakumara P, Shiva Kumar J, Raghava S, et al. Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies. J Sci Food Agric. 2017; 97(6):1698-1707. [DOI:10.1002/jsfa.8144] [PMID]
Razzaghi-Abyaneh M, Chang PK, Shams-Ghahfarokhi M, Rai M. Global health issues of aflatoxins in food and agriculture: challenges andopportunities. Front Microbiol. 2014; 5:420. [DOI:10.3389/fmicb.2014.00420][PMID]
Sohrabi N, Gharahkoli H. A seasonal study for determination of aflatoxin M1 level in dairy products in Iranshahr, Iran. Curr Med Mycol. 2016; 2(3):27-31. [DOI:10.18869/acadpub.cmm.2.3.27][PMID]
Frazzoli C, Gherardi P, Saxena N, Belluzzi G, Mantovani A. The hotspot for (global) one health in primary food production: aflatoxin M1 in dairy products. Front Public Health. 2017; 4:294. [DOI:10.3389/fpubh.2016.00294][PMID]
Ehrlich KC, Yu J, Cotty PJ. Aflatoxin biosynthesis gene clusters and flanking regions. J Appl Microbiol. 2005; 99(3):518-27. [DOI:10.1111/j.1365-2672.2005.02637.x] [PMID]
Georgianna DR, Payne GA. Genetic regulation of aflatoxin biosynthesis: From gene to genome. Fungal Genet Biol. 2009; 46(2):113-25. [DOI:10.1016/j.fgb.2008.10.011] [PMID]
Wei D, Zhou L, Selvaraj JN, Zhang C, Xing F, Zhao Y, et al. Molecular characterization of a toxigenic Aspergillus flavus isolates collected in China. J Microbiol. 2014; 52(7):559-65. [DOI:10.1007/s12275-014-3629-8] [PMID]
Dors GC, Caldas SS, Feddern V, Bemvenuti RH, Hackbart HCS, Souza MM, et al. Aflatoxins: Contamination, analysis and control. In: Guevara-González RG, editor. Aflatoxins – Biochemistry and Molecular Biology. London: IntechOpen; 2011. [DOI:10.5772/24902]
Sohrabi N, Taghizadeh M. Molecular identification of aflatoxigenic Aspergillus species in feedstuff samples. Curr Med Mycol. 2018; 4(2):1-6. [DOI:10.18502/cmm.4.2.66][PMID]
Umesha S, Manukumar HM. Advanced molecular diagnostic techniques for detection of food-borne pathogens: Current applications and future challenges. Crit Rev Food Sci Nutr. 2018; 58(1):84-104. [DOI:10.1080/10408398.2015.1126701] [PMID]
Atoui A, El Khoury A. PCR-RFLP for Aspergillus species. Methods Mol Biol. 2017; 1542:313-20. [DOI:10.1007/978-1-4939-6707-0_20] [PMID]
Diguta CF, Vincent B, Guilloux-Benatier M, Alexandre H, Rousseaux S. PCR ITS-RFLP: A useful method for identifying filamentous fungi isolates on grapes. Food Microbiol. 2011; 28(6):1145-54. [DOI:10.1016/j.fm.2011.03.006] [PMID]
Zarrin M, Erfaninejad M. Molecular variation analysis of Aspergillus flavus using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism of the internal transcribed spacer rDNA region. Exp Ther Med. 2016; 12(3):1628-32. [DOI:10.3892/etm.2016.3479][PMID]
Rahimi S, Sohrabi N, Ebrahimi M, Taghizade M, Rahimi S. Application of PCR in the detection of aflatoxinogenic and non-aflatoxinogenic strains of Aspergillus Flavus group of cattle feed isolated in Iran. J Mol Biol Res. 2016; 6(1):121-8. [DOI:10.5539/jmbr.v6n1p121]
Samson RA, Visagie CM, Houbraken J, Hong SB, Hubka V, Klaassen CH, et al. Phylogeny, identification and nomenclature of the genus Aspergillus. Stud Mycol. 2014; 78:141-73. [DOI:10.1016/j.simyco.2014.07.004][PMID]
Udomkun P, Wiredu AN, Nagle M, Müller J, Vanlauwe B, Bandyopadhyay R. Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application - A review. Food Control. 2017; 76:127-38. [DOI:10.1016/j.foodcont.2017.01.008][PMID]
Hadrich I, Makni F, Neji S, Cheikhrouhou F, Sellami H, Ayadi A. A review molecular typing methods for Aspergillus flavus isolates. Mycopathologia. 2011; 172(2):83-93. [DOI:10.1007/s11046-011-9406-x]
Ahmad MM, Ahmad M, Ali A, Hamid R, Javed S, Zainul Abdin M. Detection of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus from aflatoxin-contaminated peanuts and their differentiation using PCR-RFLP. Ann Microbiol. 2014; 64:1597-605. [DOI:10.1007/s13213-014-0803-5]
Diba K, Makhdoomi K, Mirhendi H. Molecular characterization of Aspergillus infections in an Iranian educational hospital using RAPD-PCR method. Iran J Basic Med Sci. 2014; 17(9):646-50. [PMID]
Van Pamel E, Daeseleire E, De Clercq N, Herman L, Verbeken A, Heyndrickx M, et al. Restriction analysis of an amplified rodA gene fragment to distinguish Aspergillus fumigatus var. ellipticus from Aspergillus fumigatus var. fumigatus. FEMS Microbiol Lett. 2012; 333(2):153-9. [DOI:10.1111/j.1574-6968.2012.02608.x] [PMID]
Somashekar D, Rati ER, Chandrashekar A. PCR-restriction fragment length analysis of aflR gene for differentiation and detection of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus in maize. Int J Food Microbiol. 2004; 93(1):101-7. [DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2003.10.011] [PMID]
El Khoury A, Atoui A, Rizk T, Lteif R, Kallassy M, Lebrihi A. Differentiation between Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus from pure culture and aflatoxin-contaminated grapes using PCR-RFLP analysis of aflR-aflJ intergenic spacer. J Food Sci. 2011; 76(4):M247-53. [DOI:10.1111/j.1750-3841.2011.02153.x] [PMID]
Nasri T, Hedayati MT, Abastabar M, Pasqualotto AC, Armaki MT, Hoseinnejad A, et al. PCR-RFLP on β-tubulin gene for rapid identification of the most clinically important species of Aspergillus. J Microbiol Methods. 2015; 117:144-7. [DOI:10.1016/j.mimet.2015.08.007] [PMID]
Ćurčić NŽ, Miljanić JA, Bočarov SA, Vukelić ID, Bodroža SM. PCR- RFLP method in combination with on-chip electrophoresis as a tool for determining of variability between important species of Aspergillus. Food Feed Res. 2024; 51(1):31-9. [DOI:10.5937/ffr0-49318] | ||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 230 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 436 |
||
