اخبار و اعلانات

 آمار

تعداد نشریات284
تعداد نشریات سازمان82
تعداد شماره‌ها3,081
تعداد مقالات34,377
تعداد مشاهده مقاله48,015,796
تعداد دریافت فایل اصل مقاله78,926,174
Sam, Sohrab, Farahmand, Behrokh, Ofoghi, Hamideh. (1404). Development of a Novel Indirect ELISA Assay for the Detection of SARS-CoV-2 IgG antibodies using a Highly sensitive RBD-Nucleoprotein Fusion Antigen. سامانه مدیریت نشریات علمی, 80(4), 957-968. doi: 10.32592/ARI.2025.80.4.957
Sohrab - Sam; Behrokh - Farahmand; Hamideh Ofoghi. "Development of a Novel Indirect ELISA Assay for the Detection of SARS-CoV-2 IgG antibodies using a Highly sensitive RBD-Nucleoprotein Fusion Antigen". سامانه مدیریت نشریات علمی, 80, 4, 1404, 957-968. doi: 10.32592/ARI.2025.80.4.957
Sam, Sohrab, Farahmand, Behrokh, Ofoghi, Hamideh. (1404). 'Development of a Novel Indirect ELISA Assay for the Detection of SARS-CoV-2 IgG antibodies using a Highly sensitive RBD-Nucleoprotein Fusion Antigen', سامانه مدیریت نشریات علمی, 80(4), pp. 957-968. doi: 10.32592/ARI.2025.80.4.957
Sam, Sohrab, Farahmand, Behrokh, Ofoghi, Hamideh. Development of a Novel Indirect ELISA Assay for the Detection of SARS-CoV-2 IgG antibodies using a Highly sensitive RBD-Nucleoprotein Fusion Antigen. سامانه مدیریت نشریات علمی, 1404; 80(4): 957-968. doi: 10.32592/ARI.2025.80.4.957

Development of a Novel Indirect ELISA Assay for the Detection of SARS-CoV-2 IgG antibodies using a Highly sensitive RBD-Nucleoprotein Fusion Antigen

Archives of Razi Institute
مقاله 17، دوره 80، شماره 4، مهر و آبان 2025، صفحه 957-968    اصل مقاله (503.12 K)
نوع مقاله: Original Articles
شناسه دیجیتال (DOI): 10.32592/ARI.2025.80.4.957
نویسندگان
Sohrab - Sam1؛ Behrokh - Farahmand2؛ Hamideh Ofoghi* 3
1Department of Biotechnology. Iranian research organization for science and technology (IROST). Tehran-Iran.
2Department of Influenza and Other Respiratory Viruses. Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
3Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran.
چکیده
Abstract
Background: The early and accurate diagnosis of COVID-19 is essential for efficient disease management. Traditionally, Enzyme-Linked Immunosorbent Assays for detecting IgG antibodies to SARS-CoV-2 have relied on single antigens, such as the Spike or Nucleoprotein. However, the test sensitivity has not been satisfactory. This study diverges from conventional approaches by developing an indirect ELISA assay utilizing a novel highly-sensitive fusion antigen incorporating both the Receptor-Binding Domain (RBD) and Nucleoprotein (N). The physicochemical characteristics of this unique antigen were examined and confirmed through experimental validation in our recent research. Our primary objective is to augment the diagnostic sensitivity and accuracy of the ELISA assay.
Materials and Method: The indirect ELISA assay was developed using a novel fusion antigen incorporating both the Receptor-Binding Domain (RBD) and Nucleoprotein (N) of SARS-CoV-2. Subsequently, A cohort of 112 patients presenting with COVID-19 symptoms was evaluated to detect SARS-CoV-2 RNA. Additionally, 25 serum samples from pre-pandemic healthy individuals were selected as the negative control group. The study was conducted in Tehran province, Iran, from Murch to July 2022. Serum samples from patients who tested positive using the real-time PCR method were collected, and an in-house indirect ELISA assay was developed. The sensitivity and specificity of the assay were evaluated and compared with the commercial Euroimmun anti-SARS-CoV-2 IgG assay results, which served as the gold standard. The ROC curve was analyzed using GraphPad Prism to assess the accuracy and reliability of the in-house ELISA assay.
Results: The in-house ELISA assay developed in this study demonstrated successful performance and showed 100% sensitivity and 96% specificity in detecting anti-SARS-CoV-2 IgG antibodies. Receiver operating characteristic (ROC) analysis yielded an area under the curve (AUC) of 0.976, indicating high accuracy.
Conclusions: Our in-house ELISA assay exhibits high sensitivity and specificity, highlighting its suitability for commercial development as a reliable diagnostic kit for detecting COVID-19 cases.
کلیدواژه‌ها
COVID-19؛ ELISA Assay؛ Nucleoprotein؛ Receptor Binding Domain (RBD)؛ SARS-CoV-2
عنوان مقاله [English]
توسعه یک روش الایزای غیر مستقیم جدید بمنظور شناسایی آنتی بادی های IgG کروناویروس SARS-CoV-2 با استفاده از فیوژن آنتی ژن RBD-Nucleoprotein دارای حساسیت بالا
چکیده [English]
زمینه و هدف: تشخیص زودهنگام و دقیق COVID-19 برای مدیریت موثر بیماری ضروری است. به طور مرسوم ، سنجش‌های الایزا برای تشخیص آنتی‌بادی‌های IgG مربوط به SARS-CoV-2 بر روی آنتی‌ژن‌های منفرد مانند Spike یا Nucleoprotein تکیه می‌کردند. با این حال، حساسیت تست رضایت بخش نبوده است. این مطالعه با توسعه یک روش ELISA غیرمستقیم با استفاده از یک آنتی ژن فیوژن بسیار حساس جدید که هر دو دومن اتصال گیرنده (RBD) و نوکلئوپروتئین (N) را در خود جای داده است، از رویکردهای مرسوم فاصله می‌گیرد. ویژگی های فیزیکوشیمیایی این آنتی ژن منحصر به فرد از طریق اعتبار سنجی تجربی و عملی در تحقیقات اخیر ما مورد بررسی و تایید قرار گرفت. در این مطالعه هدف اصلی ما افزایش حساسیت تشخیصی و دقت در سنجش الایزا است.
مواد و روش ها: سنجش الایزای غیرمستقیم با استفاده از یک آنتی ژن فیوژن جدید که هر دو دامنه اتصال گیرنده (RBD) و نوکلئوپروتئین (N) SARS-CoV-2 را در خود جای داده است، توسعه یافت. گروهی از 112 بیمار با علائم COVID-19 برای تشخیص RNA SARS-CoV-2 مورد ارزیابی قرار گرفتند. علاوه بر این، 25 نمونه سرم از افراد سالم به عنوان گروه کنترل منفی انتخاب شدند. این مطالعه در منطقه استان تهران ، از بهمن تا تیرماه 1400 انجام شد. نمونه‌های سرمی از بیمارانی که با استفاده از روش Real-time PCR مثبت بودند، جمع‌آوری شد و یک روش الایزای غیرمستقیم داخلی طراحی شد. حساسیت و ویژگی مربوط به این سنجش الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت و با نتایج کیت تجاری Euroimmun anti-SARS-CoV-2 IgG، که به عنوان استاندارد طلایی عمل می‌کرد، مقایسه شد. منحنی ROC با استفاده از GraphPad Prism برای ارزیابی دقت و قابلیت اطمینان سنجش ELISA داخلی تجزیه و تحلیل شد.
یافته‌ها: سنجش ELISA داخلی توسعه‌یافته در این مطالعه عملکرد موفقیت‌آمیزی را نشان داد و 100 درصد حساسیت و ویژگی 96 درصد را در تشخیص آنتی‌بادی‌های IgG ضد SARS-CoV-2 نشان داد. تجزیه و تحلیل مشخصه عملکرد گیرنده (ROC) ناحیه زیر منحنی (AUC) 0.976 را به دست آورد که نشان دهنده دقت بالا است.
نتیجه‌گیری: سنجش ELISA داخلی ما حساسیت و ویژگی بالایی را نشان می‌دهد و مناسب بودن آن را برای توسعه تجاری به عنوان یک کیت تشخیصی قابل اعتماد برای تشخیص موارد COVID-19 برجسته می‌کند.
کلیدواژه‌ها [English]
COVID-19, آزمون الایزا, حساسیت آزمون الایزا, اختصاصیت آزمون الایزا, پروتئین فیوژن, نوکلئوپروتئین, دومن متص شونده به گیرنده (RBD), ویروس SARS-COV-2
سایر فایل های مرتبط با مقاله
مراجع
  1. Gorbalenya A, Baker S, Baric RS, de Groot R, Drosten C, Gulyaeva AA, Haagmans B, Lauber C, Leontovich AM, Neuman BW, Penzar D. The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nature microbiology. 2020;5(4):536-44.
  2. V’kovski P, Kratzel A, Steiner S, Stalder H, Thiel V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 2021;19(3):155-70.
  3. Luo J, Brakel A, Krizsan A, Ludwig T, Mötzing M, Volke D, et al. Sensitive and specific serological ELISA for the detection of SARS-CoV-2 infections. Virology journal. 2022;19(1):50.
  4. de la Guardia C, Rangel G, Villarreal A, Goodridge A, Fernández PL, Lleonart R. Development of in-house, indirect ELISAs for the detection of SARS-CoV-2 spike protein-associated serology in COVID-19 patients in Panama. PloS one. 2021;16(9):e0257351.
  5. Liao WC, Adame M, Webb J, Nguyen D, Ni J. Development of Quantitative Spike and Nucleocapsid Protein-Based Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) for Measurement of Antibodies against SARS-CoV-2. The Journal of Immunology. 2022;208(1):125-23.
  6. Liu PP, Zong Y, Jiang SP, Jiao YJ, Yu XJ. Development of a nucleocapsid protein-based ELISA for detection of human IgM and IgG antibodies to SARS-CoV-2. ACS omega. 2021;6(14):9667-71.
  7. Premkumar L, Segovia-Chumbez B, Jadi R, Martinez DR, Raut R, et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science immunology. 2020;5(48):eabc8413.
  8. Chen F, Liu Z, Kang W, Jiang F, Yang X, Yin F, et al. Single-domain antibodies against SARS-CoV-2 RBD from a two-stage phage screening of universal and focused synthetic libraries. BMC Infectious Diseases. 2024;24(1):199.
  9. Barnes CO, Jette CA, Abernathy ME, Dam KM, Esswein SR, Gristick HB, et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 2020;588(7839):682-7.
  10. Tian Y, Lian C, Chen Y, Wei D, Zhang X, Ling Y, et al. Sensitivity and specificity of SARS-CoV-2 S1 subunit in COVID-19 serology assays. Cell discovery. 2020;6(1):75.
  11. Gonzalez-Hernandez M, Kaiser FK, Steffen I, Ciurkiewicz M, van Amerongen G, Tchelet R, et al. Preclinical immunogenicity and protective efficacy of a SARS-CoV-2 RBD-based vaccine produced with the thermophilic filamentous fungal expression system Thermothelomyces heterothallica C1. Frontiers in Immunology. 2023;14:1204834.
  12. Li Q, Wu J, Nie J, Zhang L, Hao H, Liu S, et al. The impact of mutations in SARS-CoV-2 spike on viral infectivity and antigenicity. Cell. 2020;182(5):1284-94.
  13. Malone B, Urakova N, Snijder EJ, Campbell EA. Structures and functions of coronavirus replication–transcription complexes and their relevance for SARS-CoV-2 drug design. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2022;23(1):21-39.
  14. Wu W, Cheng Y, Zhou H, Sun C, Zhang S. The SARS-CoV-2 nucleocapsid protein: its role in the viral life cycle, structure and functions, and use as a potential target in the development of vaccines and diagnostics. Virology journal. 2023;20(1):6.
  15. Huang JC, Chang YF, Chen KH, Su LC, Lee CW, Chen CC, et al. Detection of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus nucleocapsid protein in human serum using a localized surface plasmon coupled fluorescence fiber-optic biosensor. Biosensors and Bioelectronics. 2009;25(2):320-5.
  16. Ladner JT, Henson SN, Boyle AS, Engelbrektson AL, Fink ZW, Rahee F, et al. Epitope-resolved profiling of the SARS-CoV-2 antibody response identifies cross-reactivity with endemic human coronaviruses. Cell Reports Medicine. 2021;2(1).
  17. Liu W, Liu L, Kou G, Zheng Y, Ding Y, Ni W, et al. Evaluation of nucleocapsid and spike protein-based enzyme-linked immunosorbent assays for detecting antibodies against SARS-CoV-2. Journal of clinical microbiology. 2020;58(6):10-128.
  18. Verissimo CD, O'Brien C, Corrales JL, Dorey A, Cwiklinski K, Lalor R, Doyle JM, Field S, Masterson C, Martinez ER, Hughes G. Improved diagnosis of SARS-CoV-2 by using nucleoprotein and spike protein fragment 2 in quantitative dual ELISA tests. Epidemiology & Infection. 2021;149:e140.
  19. Reiners N, Schnurra C, Trawinski H, Kannenberg J, Hermsdorf T, Aebischer A, Schöneberg T, Reiche S, Jassoy C. Performance of a SARS CoV-2 antibody ELISA based on simultaneous measurement of antibodies against the viral nucleoprotein and receptor-binding domain. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 2021;40(12):2645-9.
  20. Sam S, Ofoghi H, Farahmand B. Developing of SARS-CoV-2 fusion protein expressed in E. coli Shuffle T7 for enhanced ELISA detection sensitivity–an integrated experimental and bioinformatic approach. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. 2024;6:1-6.
  21. Egger AE, Sahanic S, Gleiss A, Ratzinger F, Holzer B, Irsara C, et al. One-year follow-up of COVID-19 patients indicates substantial assay-dependent differences in the kinetics of SARS-CoV-2 antibodies. Microbiology Spectrum. 2022;10(6):e00597-22.
  22. Pallett SJ, Jones R, Abdulaal A, Pallett MA, Rayment M, Patel A, et al. Variability in detection of SARS-CoV-2-specific antibody responses following mild infection: a prospective multicentre cross-sectional study, London, United Kingdom, 17 April to 17 July 2020. Eurosurveillance. 2022;27(4):2002076.
  23. Lakshmikanth T, Muhammad SA, Olin A, Chen Y, Mikes J, Fagerberg L, et al, Brodin P. Human immune system variation during 1 year. Cell reports. 2020;32(3).
  24. Bei Y, Pinet K, Vrtis KB, Borgaro JG, Sun L, Campbell M, et al. Overcoming variant mutation-related impacts on viral sequencing and detection methodologies. Frontiers in Medicine. 2022;9:989913.
  25. Taffertshofer K, Walter M, Mackeben P, Kraemer J, Potapov S, Jochum S. Design and performance characteristics of the Elecsys anti-SARS-CoV-2 S assay. Frontiers in Immunology. 2022;13:1002576.
  26. Rodrigues-da-Silva RN, Conte FP, da Silva G, Carneiro-Alencar AL, Gomes PR, Kuriyama SN, Neto AA, Lima-Junior JC. Identification of B-cell linear epitopes in the nucleocapsid (N) protein B-cell linear epitopes conserved among the main SARS-CoV-2 variants. Viruses. 2023;15(4):923.
  27. Thura M, Sng JX, Ang KH, Li J, Gupta A, Hong JM, Hong CW, Zeng Q. Targeting intra-viral conserved nucleocapsid (N) proteins as novel vaccines against SARS-CoVs. Bioscience reports. 2021;41(9):BSR20211491.
  28. Fotouhi F, Salehi-Vaziri M, Farahmand B, Mostafavi E, Pouriayevali MH, Jalali T, Mazaheri V, Larijani MS, Tavakoli M, Afzali N, Zokaei A. Prolonged viral shedding and antibody persistence in patients with COVID-19. Microbes and Infection. 2021;23(4-5):104810.
  29. Sil BK, Jamiruddin MR, Haq MA, Khondoker MU, Jahan N, Khandker SS, Ali T, Oishee MJ, Kaitsuka T, Mie M, Tomizawa K. AuNP coupled rapid flow-through dot-blot immuno-assay for enhanced detection of SARS-CoV-2 specific nucleocapsid and receptor binding domain IgG. International journal of nanomedicine. 2021:4739-53.
  30. Nikbakht, G. Novel Insights into Infection and immunity. Iranian Journal of Veterinary Medicine, 2022; 16(2): 99-100.
  31. Motamed, N. An Overview of Future Development Methods of Infectious Bronchitis Vaccines. Iranian Journal of Veterinary Medicine, 2000; 18(1): 1-12.
آمار
تعداد مشاهده مقاله: 329
تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 128


counter
سامانه مدیریت نشریات علمی. طراحی و پیاده سازی از سیناوب