کاربرد نشانگرهای مولکولی RAPD برای تائید هیبریداسیون در عدس

مقدمه

عدس (Lens culinaris Medik.) گیاهی دیپلوئید (2n= 2x=14) است. این گیاه به عنوان منبعی جایگزین برای تامین پروتئین ارزان قیمت شناخته شده است. دانه عدس به طور متوسط دارای 26 درصد پروتئین است (Khazaei et al., 2019). متاسفانه ژرم پلاسم عدس زراعی تنوع ژنتیکی نسبتا کمی دارد و از طرفی بخش اعظم برنامه­های به نژادی محدود به انتخاب و گزینش توده­های بومی برتر است. دورگ گیری، شانسی برای افزایش تنوع ژنتیکی فراهم می­کند. عدس به دلیل پدیده کلیستوگامی یک گیاه خودبارور است که به طور طبیعی کمتر از 8/0درصد دگرباروری دارد. گل‌های کوچک و ظریف این گیاه کامل است و اخته کردن و به دنبال آن دورگ گیری مصنوعی آن را پرزحمت و ناموفق می­سازد. با تقویت برنامه دورگ‌گیری عدس و بهبود شرایط آن، ضمن افزایش محسوس در تعداد دورگ‌های جدید (افزایش تنوع در جمعیت اصلاحی)، میزان موفقیت در رسیدن به ارقام و لاین‌های مطلوب افزایش خواهد یافت (Suvorova, 2014). هیبریداسیون علاوه بر توسعه تنوع ژنتیکی، از طریق اینتروگرسیون الل­های مطلوب مقاومت و یا تحمل به تنش­های زیستی و غیرزیستی انتقال می­دهد (Ocampo et al., 2000). نتایج موفقی از دورگ­گیری بین لاین­های انتخابی عدس زراعی و بررسی صحت دورگ­گیری با استفاده از صفات مورفولوژیکی در داخل کشور گزارش شده است (جهانگیری، 1379؛ جهانگیری 1382). چندین مطالعه در زمینه دورگ گیری درون گونه­ای عدس انجام گرفته است (Solh et al., 1980 ;Mera and Erskin, 1982; Malaviya and Shukla, 1990; Kumar and Singh, 1998). با توجه به نتایج دورگ گیری­های بین زیرگونه­ای عدس مشاهده شده است که عدس زراعی Lens culinaris ssp. culinaris با Lens culinaris ssp. Orientalis قابل تلاقی می­باشد (Villankaurt and Slinkard, 1992) هرچند باروری هیبریدها بستگی به آرایش کروموزومی والد وحشی دارد (Ladzinsky et al., 1985) بنابراین با توجه به امکان دورگ گیری برای این گیاه می­توان هیبریدهایی را برای صفات مورد نظر تحت شرایط کنترل شده گلخانه­ای تولید کرد. در تلاقی بین عدس زراعی و گونه­های وحشی L. tomentosus دانه تشکیل می­شود ولی به تدریج جنین­ها از بین می­روند و تکنیک نجات جنین برای آن­ها مورد نیاز است. برای اولین بار هیبرید بین گونه­ای با استفاده از تکنیک نجات جنین در تلاقی بین عدس زراعی و L. erovides در اسپانیا انجام گرفت (Ladzinsky et al., 1985) و پروتوکل موثری برای احیای جنین هیبریدهایL. odemensis‏، L. erovides  و L.nigricans  گزارش کردند (Frantini and Ruiz, 2004).

صفات مورفولوژیکی برای تمایز بین بوته­ها کافی نیستند، بنابراین نشانگرهای مولکولی برای تایید صحت دورگ گیری ضروری می­باشند. کابالو و همکاران (2018) با استفاده از نشانگرهای STMS بوته­های F₁ را در گیاه نخود شناسایی کردند. در مطالعه­ای دیگر اوسی و همکاران (2020) صحت دورگ گیری را با استفاده از نشانگرهای SNP در گوجه فرنگی تایید کردند. سولانکی و همکاران (2010) به منظور تایید صحت دورگ گیری بوته­های F₁ حاصل از تلاقی PRECOZ × PL02 و Sehore 7403 × IPL 406 ، 24 بوته عدس را توسط نشانگرهای RAPD و SSR بررسی کردند. نتایج نشان داد که 8/20 درصد بوته­ها در نتیجه دورگ گیری حاصل شده­اند. شارما و همکاران (2018) با استفاده از نشانگرهای SSR صحت دورگ گیری را در گیاه خردل تایید کردند و از 20 نشانگر مورد استفاده پنج نشانگر چند شکل بودند. در آن مطالعه، وجود هر دو باند والدینی در شش بوته از هفت بوته صحت دورگ گیری را تایید نمود.

تنوع طبیعی موجود در گیاهان خود بارور زمانی که در معرض انتخاب قرار می­گیرند به شدت کاسته می­شود. برای استمرار اصلاح و ایجاد لاین­های برتر، ضروری است که همواره تنوع ژنتیکی جدیدی از طریق دورگ گیری ایجاد شود. دقت طراحی هیبریداسیون بسیار مهم است. بسته به اهداف به نژادگر، انتخاب والدین بر اساس ارزش ژنتیکی صورت می­گیرد. دقت در اداره کردن نسل‌­های در حال تفکیک بعد از هر تلاقی و تشکیل F₁ و خودباروری آن­ها از اهمیت بالایی برخوردار است (Osei et al, 2020). هدف یا اهداف برنامه هیبریداسیون می­تواند افزایش عملکرد، سازگاری، بهبود کیفیت، مقاومت به بیماری­ها یا برخی صفات ارزشمند اقتصادی باشد. به طور کلی یکی از راه­های گسترش تنوع ژنتیکی و تجمیع ژن­های مطلوب در یک ژنوتیپ و در نهایت تولید یک رقم مناسب و مطلوب، دورگ­گیری بین والدین مناسب می­باشد. بنابراین در این پروژه هدف، تلاقی بین والدین انتخابی و تولید دورگ­های جدید جهت توسعه تنوع ژنتیکی و نیز بهینه­سازی بهترین شرایط دورگ گیری جهت افزایش راندمان دورگ گیری برای عدس و در نهایت بررسی صحت دورگ­گیری در نتاج F₁ حاصل از این تلاقی­ها با استفاده از نشانگرهای مولکولی برای اولین بار در کشور می­باشد.

مواد و روش‌ها

هشت لاین و رقم که از لحاظ خصوصیات ژنتیکی و مورفولوژیکی حداکثر تفاوت را با یکدیگر دارند، به‌منظور ایجاد تنوع ژنتیکی و انتخاب ارقام پرمحصول با صفات مطلوب از جمله عملکرد بالا، پا بلندی، رنگ دانه و وزن صد دانه بین والدین انتخابی، انتخاب شدند. این والدین در بلوک­های تلاقی، تحت شرایط کنترل شده گلخانه (از جنس پلاستیک فشرده)، در دو زمان متفاوت (جهت طولانی بودن زمان گلدهی برای تلاقی) کشت شدند (جدول 1) و در زمان گلدهی با شناسایی گل­های آماده و مناسب، عملیات اخته کردن و گرده افشانی مصنوعی انجام گرفت. هر والد در خطوط 2 متری کاشته­ شد. بین والد پدری و مادری 30 سانتی­متر و بین دورگ­گیری بعدی 50 سانتی­متر فاصله در نظر گرفته شد تا این­که عملیات با سهولت انجام شود (شکل 1). گل­ها زمانی برای اخته کردن انتخاب شدند که طول گلبرگ­ها تقریبا 4/3 کاسبرگ­ها باشند. زمان انجام دورگ­گیری در ساعات ابتدایی صبح بود. هنگام اخته کردن، گل بین انگشت شست و سبابه قرار گرفت. از پنس مخصوص و تیز برای حذف کاسبرگ استفاده شد. گل را باز کرده و 10 پرچم آن را حذف کرده و بلافاصله بعد از اخته کردن، گرده افشانی دستی انجام گرفت. بعد از گرده افشانی مصنوعی،­ به وسیله نخ­های رنگی علامت گذاری شدند. در طول فصل رشد و نمو مراقبت‌های لازم زراعی (آبیاری، مبارزه با آفات و بیماری‌ها) انجام گرفت.

تهیه مواد گیاهی، استخراج DNA و واکنش زنجیره­ای پلی مراز: نمونه­های برگی به منظور استخراج DNA  ژنومی در مرحله شش برگی تهیه و در داخل ازت مایع به آزمایشگاه منتقل شد. برای استخراج DNA از روش دلاپورتا تغییر یافته (1983) استفاده شد. کمیت DNA با استفاده از روش اسپکتروفتومتری تعیین شد. همچنین، با استفاده از نسبت‌ جذب نوری 280/260 و 320 نانومتر به ترتیب آلودگی‌های پروتئینی، پلی‌ساکاریدی و پلی‌فنلی و ذرات معلق مورد بررسی قرار گرفتند. سپس نمونه‌های DNA‌ی استخراج شده توسط الکتروفورز در ژل آگارز 8/0 درصد از لحاظ شکستگی و وجود RNA بررسی شدند.

جدول 1- اسامی و مشخصات لاین­های شرکت کننده در برنامه دورگ گیری عدس

شکل 1- دورگ گیری بین والدین انتخابی عدس

در این پژوهش از نشانگرهای RAPD استفاده شد (جدول 2).  ابتدا نشانگرها بر روی والدین ارزیابی شده و نشانگرهای چند شکل انتخاب شدند. اجزای واکنش در جدول 3 بیان شده است. Master mix مورد استفاده در این آزمایش محصول شرکت Ampliqon شامل ترکیبات زیر می­باشد:

-           Tris-HCl (pH=8.5), (NH4)2SO4, 3mM MgCl2, 0.2 % Tween 20

-           0.4 mM dNTP

-           0.2 units/µl Ampliqon Taq polymerase

• Red dye

چرخه­های حرارتی واکنش زنجیره­ای پلی مراز به این صورت در نظر گرفته شد: مرحله اول: واسرشته ‌سازی اولیه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 4 دقیقه، مرحله دوم: شامل 35 چرخه متشکل از مراحل زیر: واسرشته ‌سازی ثانویه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1دقیقه، اتصال آغازگرها در دمای 40 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، بسط در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 دقیقه و مرحله سوم: بسط نهایی به مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد‌.

جداسازی و آشکارسازی قطعات تکثیری با استفاده از ژل آگارز 5/1 درصد در دستگاه الکتروفورز ساخت شرکت Biocom و منبع تغذیه الکتروفورز ساخت شرکت Consort با ولتاژ 130 ولت به مدت 5/2 ساعت و با استفاده از بافر 1X TBE انجام گرفت. قطعات تکثیری توسط نور UV و دستگاه uvTrancilluminator ساخت شرکت Biocom آشکار سازی شدند.

جدول 2- اسامی و مشخصات آغازگرهای RAPD

جدول 3- اجزای واکنش PCR

نتایج و بحث

استفاده از نشانگرهای مولکولی در عدس، در مقایسه با سایر گیاهان مانند گندم محدودتر می­باشد. دلیل این موضوع مطالعات کمتر توالی یابی در این گیاه است، لذا امکان طراحی نشانگر برای تعیین چند شکلی در این گیاه محدودتر است. از جمله نشانگرهایی که در مطالعات تنوع ژنتیکی عدس بیشتر مورد استفاده قرار گرفته­اند، نشانگرهای RAPD، SSR، AFLP و RFLP  می­باشند (Dikshit et al, 2015; Mansi et al, 2019; Reddy et al, 2010). بنابراین در این مطالعه از نشانگرهای RAPD برای مطالعه چند شکلی والدین و شناسایی F₁ صحیح استفاده شده است.

کمیت و کیفیت DNA: در نتیجه استخراج DNA ، رسوب DNA با رنگ سفید تا شیری حاصل شد. کیفیت و کمیت بالای DNA یکی از معیارهای موفقیت در واکنش زنجیره­ای پلی­مراز می­باشد. نتایج اسپکتروفتومتری برای تعیین کمیت و کیفیت DNA در جدول 4 نشان داده شده است که در آن برای تعیین کیفیت نمونه­ها از نسبت جذب نوری 260 به 280 استفاده شد. از آنجائی­که بیشترین جذب نور در اسیدهای نوکلئیک در طول موج 260 نانومتر صورت می­گیرد و چون بیشترین آلاینده­های اسید نوکلئیک پروتئین­ها هستند و نور را در طول موج 280 نانومتر جذب می­کنند، بنابراین این نسبت می­تواند به عنوان معیار کیفیت DNA مطرح باشد. همچنین، با استفاده از نسبت جذب 320 نانومتری آلودگی­های پلی­ساکاریدی و پلی فنولی و ذرات معلق نیز بررسی شد. الکتروفورز DNAهای حاصل توسط ژل آگارز 8/0 درصد، نوارهای فاقد کشیدگی و عدم توقف DNA در چاهک‌ها را نشان داد (شکل 2). این نتایج حاکی از خلوص DNA و عاری بودن آن از آلودگی‌های RNA و پلی‌ساکاریدها بود.

جدول 4- نتایج اسپکتروفتومتری برای تعیین کمیت و کیفیت DNAی نمونه­های عدس

شکل 2- کیفیت نمونه‌هایی از DNA استخراج شده در ژل آگارز 8/0 درصد

نتایج دورگ گیری و چند شکلی بین والدین: دورگ‌گیری از نیمه دوم اردیبهشت در گلخانه آغاز شد. در مجموع از 230 تلاقی انجام شده، تعداد 49 تلاقی موفق و 69  بذر حاصل شد (جدول 5). 14 عدد نشانگر RAPD برای بررسی چند شکلی بین والدین کیمیا، بیله سوار، پرکوز، سنا، ILL10728،  Qaz89-90-PR65، Qaz89-90-PR67 و FLIP2013-13L استفاده شد که 11 عدد از این نشانگرها بین والدین چند شکل بودند، لذا در بررسی نتاج مورد استفاده قرار گرفتند. در کل، 63 الل RAPD از 287 عدد چند شکل بود (جدول 6).  از این تعداد الل چند شکل، 60 عدد مختص ژنوتیپ پدری بود. بیشترین الل اختصاصی والد پدری توسط نشانگرهای  OPD-20،  OPJ-18 و OPM-16 مشاهده شد. کمترین الل اختصاصی نیز مربوط به نشانگرهای OPD-10، OPB-13، OPM-12 و OPD-18 بود. الل­های چند شکل شناسایی شده در این مطالعه برای اهداف مختلف از جمله برنامه­های تایید دورگ گیری می­تواند مفید باشد.

بررسی صحت دورگ گیری در نتاج F₁: در این پروژه‏ پنج بوته F₁ حاصل از هر شش تلاقی توسط نشانگرهای RAPD مطالعه شدند. در بررسی­های مولکولی از آنجائی­که نتاج F₁ از بوته­های مادری برداشت شده­اند، وجود باند مشترک بین نتاج F₁ و والد پدری نشان دهنده تایید صحت دورگ گیری می­باشد. همانطور که در جدول 7 مشاهده می­شود صحت دورگ­گیری بوته­های F₁ حاصل از تلاقی دوم یعنی Kimia × QAZ89-90-PR65 توسط 72 % نشانگرها (هشت نشانگر از 11 نشانگر) تایید شد. بوته­های حاصل از تلاقی Bilesavar × Qaz89-90-PR67 در رتبه بعدی بودند و 63 % از نشانگرها دورگ­گیری را در این تلاقی تایید کردند. نشانگر OPD-20 در تمام تلاقی­های انجام گرفته، انجام دورگ­گیری را در اغلب بوته­ها تایید کرد. نشانگرهای OPM-16، OPJ-18 و OPG-02 با تشکیل باند پلی مورف در چهار تلاقی، در رتبه بعدی قرار داشتند.

جدول 5- نتایج حاصل از  برنامه دورگ گیری گلخانه عدس

جدول 6- جزئیات باندهای تکثیری توسط نشانگرهای RAPD

نشانگرهای OPB-13، OPD-18 و OPM-14 فقط در دو تلاقی، باند پلی مورف و مختص والد پدری را تشکیل دادند. طبق اطلاعات ارائه شده در جدول 7، در نتایج حاصل از تلاقی­های چهار، پنج و شش صحت دورگ­گیری برای هر پنج بوته تایید شد. در شکل 3، باندهای تکثیر شده توسط نشانگر OPG-12 برای تلاقی ششم، نشان داده شده است. همانطور که مشاهده می­شود باند اختصاصی والد پدری در تمام پنج بوته مشاهده می­شود. در شکل 4 وجود باند پدری در تمام پنج بوته توسط نشانگر OPD-10 در تلاقی اول مشاهده می­شود.

در شکل 5 نیز نتایج حاصل از نشانگر OPD-18 بر روی تلاقی پنج مشاهده می­شود. کاربرد نشانگرها در شناسایی صحت هیبریداسیون در سایر گیاهان نیز گزارش شده است (Paran et al, 1995; Muhammad et al, 2008).

در تلاقی­های یک، دو و سه فقط چهار بوته به عنوان F₁ واقعی شناسایی شدند. یک نمونه در شکل 6 مشاهده می­شود که مربوط به نشانگر OPJ-18 بر روی تلاقی دوم است. در این تلاقی، صحت دورگ­گیری در بوته شماره سه توسط این نشانگر تایید نشده است. دلیل این امر می­تواند خودباروری و یا مخلوط شدن با سایر بذور در زمان کاشت باشد.

در تلاقی اول یعنی kimia ILL10728 ×، صحت دورگ­گیری بوته­های یک، سه، چهار و پنج به ترتیب توسط سه، پنج، شش و چهار نشانگر تایید شد.

شکل 3- نتایج واکنش زنجیره­ای پلیمراز توسط نشانگر OPG-12 بر روی تلاقی ششم

از چپ به راست: والد مادری، بوته­های 1 تا 5 و والد پدری

شکل 4- نتایج واکنش زنجیره­ای پلیمراز توسط نشانگر OPD-10 بر روی تلاقی اول

از چپ به راست: والد مادری، بوته­های 1 تا 5 و والد پدری

شکل 5- نتایج حاصل از نشانگر OPD-18 بر روی تلاقی پنجم

از چپ به راست: والد مادری، بوته­های 1 تا 5 و والد پدری

شکل 6- نتایج حاصل از نشانگر OPJ-18 بر روی تلاقی دوم

از چپ به راست: والد مادری، بوته­های 1 تا 5 و والد پدری

جدول 7- مشخصات بوته­های F₁ تایید شده توسط نشانگرهای RAPD

جدول 8- برخی از صفات لاین­ها، ارقام و دورگ­های حاصل

در تلاقی دوم Kimia × QAZ89-90-PR65 صحت  دورگ­ گیری بوته های  یک، دو، چهار و پنج هر کدام توسط شش نشانگر تایید شد. این مقدار برای تلاقی سوم Kimia × Sana برای بوته­های دو، سه، چهار و پنج به ترتیب سه، دو، پنج و پنج نشانگر بود. در رابطه با تلاقی چهارم یعنی Bilesavar × Precoz بوته­های یک، دو، سه، چهار و پنج توسط سه، دو، چهار، پنج و چهار نشانگر تایید شدند. تلاقی پنجم Bilesavar × Qaz89-90-PR67 به ترتیب چهار، پنج، شش، شش، هفت نشانگر بوته­های F₁ صحیح را شناسایی کردند. نهایتا در آخرین تلاقی ILL10728 × FLIP2013-13L بوته­های یک، دو، سه، چهار و پنج توسط دو، دو، چهار، پنج و پنج نشانگر تایید اعتبار شدند.

نتیجه­گیری

با توجه به نتایج این تحقیق می­توان بیان کرد که شناسایی F₁های صحیح توسط نشانگرهای مولکولی احتمال خطا را در برنامه­های به نژادی و اداره نسل­های در حال تفکیک بشدت کاهش می­دهد. با توجه به این­که در اغلب موارد صفات مورد نظر برای انتقال، در نسل­های اولیه مشاهده نمی­شوند و گزینش برای این صفات به نسل­های پیشرفته­تر موکول می­شود بنابراین، استفاده از روش مولکولی از نظر زمان و هزینه مقرون به صرفه بوده و از طرفی دقت بالاتری داشته و احتمال تشکیل جمعیت­های نادرست را کاهش می­دهد.