بررسی تاثیرتنش شوری بر پتانسیل اسمزی، میزان غلظت قندها و پروتئین های محلول در ژنوتیپ های مختلف برنج در مرحله گیاهچه ای

مقدمه
فرآیند نگهداری تورژسانس سلولی بوسیله افزایش کافی محلولهای سلولی جهت جبران پتانسیل اسمزی خارجی، تنظیم اسمزی و یا تعادل اسمزی نامیده می شود (مونز و ترمات، 1986). در پتانسیل آب برگ و تنظیم اسمزی در ارقام مختلف برنج با سابقه ژنتیکی متفاوت اختلاف ژنتیکی گزارش شده است (لیلی، 1996). گیاهان مقاوم به شوری باید دارای توانایی تنظیم فشار اسمزی بوسیله تنظیم اسمزی باشند. گیاهان به استثناء زمانی که شوری خیلی زیاد است، اغلب می توانند پتانسیل کاهش یافته را بدون از دست دادن آب تنظیم کنند. تنظیم اسمزی حدود یک بار در روز در گیاهان مشاهده شده است ( برن استین، 1963)، اما میزان آن به گونه گیاهی بستگی دارد. خسارت اسمزی می تواند در نتیجه غلظت های بالای سدیم ( احتمالا" تا چند صد میلی مول) در اپوپلاست برگها رخ دهد، هنگامی که سدیم  از طریق جریان تعرقی  وارد برگ ها شده و پس از ، از دست رفتن آب در برگ ها باقی می ماند، این وضعیت بوسیله آنالیزهای اشعه x در برگ های برنج مشاهده شده است، این نویسندگان حدود 600 میلی مول سدیم را در اپوپلاست برگ های برنج تحت تنش متوسط شوری گزارش کردند(فلورز و همکاران، 1991  ). تعادل اسمزی، جذب و تجمع یونها و سنتز محلولهای آلی را شامل می شود. بسیاری از گلیکوفیتها توانایی تعادل اسمزی را دارند و محلولهای آلی نقش اصلی را در مورد آنها بازی می کنند ( گرین وی و موتر، 1980). تعادل اسمزی براساس سنتز محلولهای آلی است و به انرژی قابل مصرف زیادی نیاز دارند، در صورتی که تجمع یونها در درون واکوئلها از نظر انرژی، محلول خیلی ارزانی را برای  تنظیم فراهم می کنند (فلورز و همکاران، 1977)، چون که سهم متفاوت محلولهای آلی وغیر آلی برای تنطیم اسمزی ضمانت مهمی برای تعادل انرژی است ( وین جونز، 1981). بابو و همکاران (1999) با آزمایش انواع مختلف برنج در شرایط تنش خشکی دریافتند که تنوع زیادی از نظر تنظیم اسمزی وجود دارد.                                                                                                                         
تنظیم اسمزی فصلی در سورگوم و ذرت رشد یافته در مزرعه در پاسخ به تنش کم آبی دیده شده است. کاملی1 و لوسل2 بین تغییرات قند‌های محلول و پتانسیل اسمزی در ذرت و سورگوم همبستگی بالایی را یافتند(علی و همکاران، 1999 ).
           افزایش در غلظت ساکارز و سطح قند های محلول تحت شرایط تنش شوری در سازگاری و ایجاد تحمل به شوری احتمالا" نقش دارد ( جی هات و همکاران، 2005 ) و از بین ترکیبات آلی مختلف، قندها بیش از 50% مجموع مواد متشکله پتانسیل اسمزی را تشکیل می دهند ( کرام، 1976  ). براساس برخی مطالعات  اثرات کلرید سدیم  در لوبیا که گونه ای حساس است میزان ساکارز برگ افزایش یافته است، اما در برنج که مقاومتی متوسط دارد این میزان کمتر بوده؛ در حالی که در سویا که مقاومت آن هم متوسط است اندکی کاهش یافته و در پنبه که مقاوم است بیشتر کاهش داشته است ( رادرت، 1984 ). متابولیسم قندها به شکل نامطلوبی در گیاهان تحت تنش شوری تحت تاثیر قرار می گیرد ( دوبی، 1997). در برگ گلی کوفیت ها محتوای قند های محلول تحت تنش شوری ( روسن و همکاران، 1998)، تنش رطوبتی ( فویرو همکاران، 1998)، تنش سرما ( هیوری و همکاران، 1995) و طی پیری ( وینگلر، 1998)  افزایش می یابد. ارقام مختلف برنج در عکس العمل به تنش شوری دامنه گسترده ای از بسیار حساس تا متحمل را در بر می گیرد ( شانون و همکاران، 1998)، از این رو تغییرات مورفولوژیکی میتواند با متابولیت های مختلف غیر نرمال طی مرحله جوانه زنی و گیاهچه ای همبستگی داشته باشد ( دوبی و رانی، 1989). نتایج برخی مطالعات نشان داد که شوری موجب تجزیه نشاسته و تجمع قندها در گیاهچه های برنج شده است، این افزایش با فعالیت بیشتر آنزیم هایی نظیر نشاسته فسفریلاز، ساکارز فسفات سینتاز و کاهش فعالیت اینورتاز همراه بوده است، بعلاوه فعالیت این آنزیم ها در ارقام حساس و متحمل برنج تحت تنش شوری متفاوت بوده است ( دوبی، 1997).   پروتئین های مختلفی در گونه های گیاهی تحت اثر تنش شوری شناخته شده اند (اشرف و هریس، 2004). پاریک  و همکاران(1997)  پیشنهاد کرد که پروتئین ها می توانند بعنوان مارکرهای بسیار مهم جهت بهبودی تحمل شوری در تکنیک های مهندسی ژنتیک بکار روند ، هر چند که پروتئین های تولید شده تحت تنش شوری همیشه با القاء تحمل به شوری در کوتاه مدت ارتباط ندارند و بسیاری از آنها در فرایندهای نموی درگیر هستند ( دی سوزا فیلو و همکاران، 2003). ژنهای مختلف بیان شده در عکس العمل به تنش شوری شناخته شده اند(شی نو زاکی، 1999 و کاواساکی و همکاران، 2001). برخی از این ژنها برای کد کردن پروتئینهای حفاظت کننده نظیر اسموتین(زنگ، 2000)،پروتئین های رویان زایی (اسپیلوند و همکاران، 1992)و پروتئین های ناقل(بیزل و ریوونی، 1994)، و برخی برای کد کردن آنزیمهای خاصی که در فرایندهای متابولیکی ویژه ای در شرایط شوری دخالت داشته بکار می روند(،کوش من،1992 و گونگ و همکاران،2001 ). دوبی (1994) نشان داد که شوری سنتز پروتئین های معینی را بالا می برد و باعث کاهش یا افزایش سطح کل ویا پروتئین های محلول شده که بستگی به قسمت مورد مطالعه  گیاه  دارد و منجر به افزایش فعالیت و سنتز بسیاری از آنزیمهای عمل کننده در متابولیسم پروتئین می شود. در گونه های مختلف گیاهی، کاهش در سطح پروتئین بخشهایی از گیاه که تحت اثر شوری قرار می گیرد به کاهش در سنتز پروتئین، کم شدن درجه فراهمی اسید های آمینه و ماهیت آنزیمهای دخالت کننده در سنتز پروتئین و اسیدهای آمینه ، نسبت داده می شود ( لویت، 1980). برعکس افزایش سطح پروتئین بر اثر شوری که در چندین گیاه گزارش شده ناشی از افزایش  سنتز پروتئین های قبلی و یک سری از پروتئن های جدید است (دوبی و رانی، 1989 ). اما در برخی موارد کاهش سنتز پروتئین ها ناشی از اختلال در متابولیسم اسیدهای آمینه است که این وضعیت در نهال های نخود و برگهای باقلا دیده شد(شی ویاکو و لیونووا، 1975). در آزمایشات انجام گرفته بر روی برنج محتوای پروتئینهای محلول تحت اثر تیمار شوری یک افزایش پس از 15 روز و یک کاهش را پس از 25 روز نشان داد (میسرا و همکاران،1997).                      
  مواد و روش ها
- محل و زمان انجام آزمایش
این آزمایش در سالهای 86-1385 در شرایط گلخانه ای در پژوهشکدة بیوتکنولوژی کشاورزی کرج انجام شد.
 - تنظیم اسمزی
- روش اعمال تنش
در این آزمایش, 2 رقم ایرانی برنج نسبتا"متحمل ( موسی طارم و غریب ) انتخاب و به همراه لاینهای IR651  و  IR29  ( به ترتیب متحمل و حساس) مجموعاً شامل چهار رقم درمرحله رویشی کشت داده شد. در این آزمایش, زمان آغاز تنش 21 روز پس ازکاشت و دوره اعمال تنش نیز یک هفته بود. شوری در دو سطح نرمال وEC12   دسی زیمنس بر متر مربع اعمال شد. تعداد تکرار این آزمایش 3  وبصورت اسپلیت پلات در زمان  در قالب طرح کاملاً تصادفی اجراء شد و تا پایان یک هفته، پتانسیل اسمزی، میزان قند ها و پروتئین های محلول  در زمان های 0، 4، 12، 24، 48، 96 و 168 ساعت در برگهای ششم اندازه گیری شد.
برای اندازه‌گیری پتانسیل اسمزی از برگ ششم هر گیاه استفاده شد نمونه های برگی را پس از جدا کردن از بوته ها درون تیوب های مملو از آب مقطر قرار داده و برای مدت 24 ساعت در سردخانه، تحت شرایط تاریکی و دمای 0C4 به منظور حذف اختلاف ناشی از پتانسیل ترگر نگهداری شد، بعدازآن نمونه های برگی از درون تیوب ها خارج گردیدو  فوراً در داخل ورق آلومینیوم پیچیده و در ازت مایع منجمد و تا فرا رسیدن زمان مناسب جهت اندازه‌گیری به فریزر منتقل شد. از دستگاه اسمومتر مدل Wescor- 5520 ساخت سال 2004 برای اندازه‌گیری این پارامتر استفاده شد. برای این منظور نمونه‌ها از فریزر خارج گردید و سپس با استفاده از دستگاه پرس برگ, عصاره برگ بر روی دیسک‌های کاغذی مخصوص دستگاه ریخته شد و دیسک‌ها بلافاصله در محفظة دستگاه اسمومتر قرار داده شد و دستگاه مقدار اسمولایت‌ها را بر حسب واحد مول بر لیتر مشخص نمود. سپس با استفاده از فرمول وانت هوف مقدار پتانسیل اسمزی برگ محاسبه گردید (بیرس و کول،1970).  
Ψs (MPa) = - M I R T  
یا
Ψs (MPa) = - M (mmol kg-1)2.58 10-3
 در این معادله M مولاریتة محلول، I ضریب یونیزاسیون، R ثابت عمومی گازها برابر با 0083143/0 (MPa mol-1 K-1)، T دما بر حسب درجة کلوین (°C273 ) می‌باشد که در این صورت پتانسیل اسمزی ψs بر حسب مگاپاسکال محاسبه می‌شود.
بر اساس روش پیشنهادی  بابو و همکاران (1999) اندازه گیری تنظیم اسمزی به روش محاسبه اختلاف بین پتانسیل اسمزی برگ گیاه نرمال و برگ گیاه تحت تنش محاسبه می شود.
- اندازه گیری میزان کل قندها
مقدار کل قندهای محلول به روش فنل- اسید سولفوریک اندازه گیری شد. پیش از شروع کار سه محلول سولفات روی 5%، هیدروکسید باریم 3/0 نرمال و محلول 5% فنل تهیه گردید.
- روش کار:
1- نمونه برگی که قبلآ خشک شده است را آسیاب نموده و آنرا از غربال مش 8 عبور دادیم. ( نمونه های برگ در دمای 0c70 به مدت 48 ساعت خشک شد.)
2- 1/0 گرم پودر غربال شده را به تیوب های در پیچ دار منتقل کردیم.
3- مقدار 15 میلی لیتر اتانول 80% را که قبلآ گرم کرده به لوله اضافه نموده و لوله را به مدت 20 دقیقه مخلوط کردیم.
4- به منظور جدا کردن فاز مایع از جامد، تیوب ها را به مدت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفوز کردیم.
5- عصاره ( فاز مایع ) هر نمونه را در داخل پتری ریختیم.
6- پتری ها را به مدت 1 ساعت در دمای 0c50 نگه داشته تا اتانل آن تبخیر شد.
7- پس از تبخیر الکل، مقدار 100 میلی لیتر آب مقطر به پتری ها افزوده و این محلول را به یک ظرف 250 میلی لیتر منتقل نمودیم.
8- به منظور حذف رسوبات اضافی و ترکیبات دیگر، 5 میلی لیتر سولفات روی 5% و 7/4 میلی لیتر هیدروکسید باریم 3/0 نرمال را به آن اضافه کردیم.
9- مقدار 45 میلی لیتر از هر نمونه را برداشته و به مدت 10 دقیقه با سرعت g 3000 سانتریفوژ کردیم.
10- عصاره شناور را در یک ظرف دیگر جمع آوری نموده و 2 میلی لیتر از آنرا به لوله ازمایش منتقل کردیم.
11- به هر لوله آزمایش مقدار 1 میلی لیتر محلول 5% فنل افزودیم. درب لوله را بسته و آنرا به شدت تکان دادیم تا محلول کف کرد.
12- زیر هود و به سرعت بوسیله سرنگ مقدار 5 میلی لیتر اسید سولفوریک 98% به داخل هر یک از نمونه ها اضافه کردیم. پس از این مرحله قند محلول در هر یک از نمونه ها به رنگ نارنجی تغییر رنگ داد.
13- پس از 45 دقیقه و با تثبیت رنگ قهوه ای مایل به زرد، میزان جذب نور را با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm485 قرائت کردیم.
- اندازه گیری مقدار کل پروتئین
     برای سنجش غلظت پروتئین محلول به روش برادفورد (Bradford) (1976)عمل شد، بدین ترتیب که ابتدا محلول های مورد نیاز جهت استخراج پروتئین به قرار زیر استخراج شد.
1-بافراستخراج ( Tris-HCl): برای تهیه یک لیتر محلول استخراج، میزان 4/121 گرم تریس در یک لیتر آب مقطر حل کرده و اسیدیته محلول توسط اسید کلریدریک نرمال به 8/6 رسانده شد.
2- معرف Bradford: برای تهیه این معرف مقدار 100 میلی گرمComassie Brilliant Blue G-250 ) ( را در 50میلی لیتر اتانول 95% حل کرده و به مدت یک ساعت عمل هم زدن به منطور حل شدن کامل صورت گرفت. سپس 100 میلی لیتر اسید فسفریک 85% قطره قطره به محلول اضافه شد و حجم محلول کل با کمک اب مقطر به یک لیتر رسانده شد، محلول از کاغذ صافی واتمن ( نمره یک ) عبور داده شد.
کلیه مراحل استخراج پروتئین از بافت گیاهی در سردخانه و در دمای 0c4- انجام گرفت.بافت گیاهی ( برگ رفرنس )پس از انتقال از گلخانه به ازمایشگاه بوسیله فلاسک ازت مایع، سریعا" توزین شده و در بسته های یک گرمی درون ورقه های آلومینیوم تا زمان عصاره گیری در فریزر 0C40- نگه داری شد، استخراج پروتئین در هاون های چینی و میزان جذب نوری محلول حاصل با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج nm595 قرائت شد.
نتایج :
- شوری و متابولیسم کربوهیدراتها
روند تغییرات میزان قندهای محلول در آزمایش انجام گرفته در شکل 1 نشان داده شده است. پس از آغاز تنش شوری میزان قندهای محلول در رقم متحمل به شوری IR651 بصورت معنی داری افزایش  یافت و روند افزایش تا  آخر دوره تنش ادامه یافت . بگونه ای که میزان قند محلول از  mgg-1dw4/36 پیش از اعمال تنش به mgg-1dw  87 در پایان دوره  تنش رسید و تفاوت معنی داری را با تیمار کنترل نشان داد. در سایر ارقام روند تغییرات به گونه ای دیگر بود،  در رقم IR29 پس از یک افزایش نسبی طی 12 ساعت پس از اعمال تنش ( که البته این تغییرات معنی دار هم نبوده است) مقدار قندهای محلول کاهش نشان داد و شبیه وضعیت تیمار شاهد شد. حد اکثر میزان تجمع قند در این رقم 4 ساعت پس از اعمال  تنش به میزان  mgg-1dw  45 و در پایان دوره اعمال تنش نظیر تیمار نرمال ومقدار آن mgg-1dw 36  بود.  میزان قند محلول در ارقام ایرانی موسی طارم و غریب تحت اثر تیمار تنش کاهش نشان داد، کاهش میزان قندهای محلول در رقم موسی معنی دار نبوده است ولی در رقم غریب کاهش میزان قندها طی 24 ساعت اولیه تفاوت معنی داری را با تیمار شاهد نظیر خود داشت.
- شوری و متابولیسم پروتئین

روند تغییرات پروتئین در تیمار شوری ( شکل2) بیانگر عدم تغییر و یا یک افزایش نسبی پس از 24 ساعت از زمان شروع تنش نسبت به زمان صفر در IR651 و غریب  بود؛ با این تفاوت که در رقم متحمل به شوری ( IR651)  پس از 24 ساعت میزان پروتئین های محلول کاهش نیافت و میزان آن تا آخر دوره اعمال تنش ( 168 ساعت) بیش از وضعیت نرمال باقی ماند. مقدار پروتئین اندازه گیری شده پس از 24 و 168 ساعت در این رقم تحت اثر تیمار شوری به ترتیب 92 و 102 میلی گرم بر گرم وزن تر بود، که البته علی رغم افزایش نسبی ولی اختلاف معنی دار نبود، حال آنکه در سایر ارقام در پایان آزمایش میزان پروتئین ها بصورت معنی داری نسبت به زمان 24 ساعت کاهش داشت. در ارقام IR29 ، موسی طارم و غریب میزان پروتئین پس از 24 ساعت به ترتیب 89، 120 و113 میلی گرم بر گرم وزن تر و پس از 168 ساعت این مقادیر به 66، 86 و 92  میلی گرم بر گرم وزن ترکاهش یافت ( شکل2).
نکته قابل توجه اینکه میزان پروتئین در کلیه ارقام  پس از 24 ساعت باستثناء رقم مقاوم به شوری (IR651) روند کاهشی داشته است( شکل 2).    
- پتانسیل اسمزی

روند تغییرات پتانسیل اسمزی در شکل 3 نشان داده شده است. بررسی روند تغییرات پتانسیل اسمزی تحت شرایط تنش در ارقام خارجی و ایرانی برتری رقم مقاوم به شوری ( IR651) را نشان داد. پس از یک نوسان اولیه که همراه با کاهش در پتانسیل اسمزی پس از 4 ساعت بود، با گذشت زمان میزان پتانسیل اسمزی به شکل معنی داری افزایش ( منفی تر) یافت، و این افزایش تا آخر دوره اعمال تنش ادامه داشت. روند تغییرات پتانسیل اسمزی در IR651 در شرایط نرمال عکس تیمار تنشی در این رقم بود ( شکل 3 )، بطوری که در زمان قبل از اعمال تنش ( صفر) پتانسیل اسمزی از08/1- به 95/0- مگاپاسکال در وضعیت نرمال ( مثبت تر )  اما در وضعیت تنش این مقادیربرای زمان های مذکور به ترتیب از MPa 08/1- به43/1-  ( منفی تر ) کاهش پیدا کرد. این خصوصیت بیانگر کارآمد بودن تنظیم اسمزی در متحمل ساختن این رقم به شوری بود.
مطالعه روند تغییرات پتانسیل اسمزی در سایر ارقام IR29،  موسی طارم و غریب عدم وجود اختلاف معنی دار را درمقایسه  وضعیت نرمال و تنش درهر یک از ارقام را نشان داد (شکل 3 ).   
بحث و نتیجه گیری
از جمله عکس العمل های متابولیکی به تنش شوری سنتز اسمولیت های سازگار است. این ترکیبات آلی در تنظیم اسمزی دخالت دارند و موجب حفاظت ساختمان ارگانلهای مختلف سلول از خسارتهای اکسیداتیو می شود (Smirnoff, 1993 ). نتایج آزمایش صورت گرفته نشان داد که، تفاوت معنی داری بین ارقام، سطوح شوری و اثرات متقابل آنها در صفات مطالعه شده وجود دارد ( جدول 1) و این تفاوتها طی زمان بیشتر گردید.  از جمله اینکه غلظت قندهای محلول در رقم متحمل به شوری IR651 به شکل فزاینده ای تحت اثر تیمار تنش تغییر پیدا کرده است، در حالی که غلظت قندهای محلول در ارقام ایرانی کاهش یافت و در رقم حساس IR29 تغییری پیدا نکرد( شکل 1). تغییرات قندهای محلول و فروکتان ها شاخص حساس و مناسبی جهت ارزیابی تحمل به خشکی و یا شوری جهت گزینش بین ارقام می تواند باشد (Kerepesi and Galiba, 2000). افزایش در غلظت ساکارز و سطح قند های محلول تحت شرایط تنش شوری در سازگاری و ایجاد تحمل به شوری احتمالا" نقش دارد ( Gehlot et al.,, 2005 ) و از بین ترکیبات آلی مختلف، قندها بیش از 50% مجموع مواد متشکله پتانسیل اسمزی را تشکیل می دهند ( Cram, 1976  ). بررسی منحنی های پتانسیل اسمزی، کاهش پتانسیل اسمزی  در رقم متحمل به شوری (IR651) را نشان داد( شکل 3)، با توجه به افزایش معنی دار غلظت قند های محلول در این رقم کاهش پتانسیل اسمزی قابل توجیه می باشد، همانطور که پیشتر عنوان شد افزایش اسمولیت های سازگار در سلولهای گیاهی تحت تنش در جذب آب و حفظ آماس سلولی به جهت متعادل نگاه داشتن فعالیت های متابولیکی سلول نقش تعیین کننده دارند. در سایر ارقام تغییرات پتانسیل اسمزی غیرمعنی دار بوده است. از این رو مکانیسم افزایش قندهای محلول در شرایط شوری یک راه کار کارآمد در رقم متحمل تلقی می شود که سایرارقام در این آزمایش فاقد چنین مکانیسمی بودند. از دیگر تغییرات متابولیکی در شرایط تنش شوری را می توان در تغییر غلظت پروتئین های محلول جستجو کرد.
عقیده عمومی این است که تنش شوری باعث کاهش قابل ملاحظه ای در مقدار پروتئین گیاه می گردد و یا اینکه با افزایش پروتئین‌ها همراه نیست ( هلال و منگال، 1979؛ اشرف و اولیاری، 1999)، در آزمایش صورت گرفته در رقم متحمل روند تغییرات بعد از 12 ساعت از آغاز اعمال تنش علی رغم غیر معنی دار بودن بصورت افزایشی بوده است و در آخر دوره اعمال تنش میزان آن در حدود mg.g-1Fw 100 بود، ، افزایش سنتز پروتئین هم در جو مقاوم به شوری، آفتابگردان، برنج و ارزن گزارش شده است (اوما و همکاران، 1995). در سایر ارقام این آزمایش پس از 48 ساعت از آغاز تنش روند تغییرات پروتئین های محلول نسبت  به شرایط نرمال بصورت کاهشی بوده است و حداکثر آن در سایر ارقام بین 70 تا mg.g-1Fw 80 بود(شکل 2). البته بوضوح روشن نیست که آیا این کاهش در نتیجه تخریب پروتئین یا کم وارد شدن اسیدهای آمینه در پروتئینها می باشد ( گارگ و همکاران، 1990). لذا روند تجمع پروتئین های محلول می تواند وجه تمایز دیگر ی در مقایسه رقم متحمل (IR651) با سایر ارقام در این آزمایش باشد.
  در برخی گزارشات آمده که پروتئین ها می توانند بعنوان مارکر در تنش های مربوط به تحمل شوری در مهندسی ژنتیک بکار روند اما برخی تحقبقات نشان داده که پروتئین های سنتز شده در وضعیت شوری همیشه با القاء تحمل در ارتباط نیستند ( Pareek et al., 1997 ). در تحقیق صورت گرفته شاخص تغییرات غلظت قندها بدلیل تغییرات بسبار آشکار در وضعیت تنش نسبت به تغییر غلظت پروتئین ها پاسخ مناسب تری جهت ارزیابی تحمل شوری در بین ژنوتیپ ها تلقی می شود.

پاورقی ها

Kameli
Losel