بررسی صفات فیزیولوژیکی خلر و جو در کشت خالص و مخلوط در شرایط آبی و دیم

مقدمه

در نواحی گرمسیری و نیمه گرمسیری مانند ایران، آب مهمترین عامل محدود کننده تولیدات کشاورزی بوده و باید سعی نمود که با حداکثر بهره برداری از آب موجود میزان تولید را افزایش داد. یکی از راههای رسیدن به این مقصود انجام چند کشتی و کشت مخلوط گیاهان مختلف می باشد(Mazaheri,1994). صفاتی مانند عمق ریشه به قسمت هوایی، سطح ویژه برگ، محتوای آب نسبی(Merah, 2001) و مقاومت روزنه‏ای(Zebri et al.,1991) جزو صفات اجتناب از تنش می باشند. در حالیکه پایداری غشای سلولی(Jiang and Huang, 2001) ، فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانت چون کاتالاز، پراکسیداز و سوپر اکسید دسموتاز و انتقال مجدد ماده خشک و نیتروژن(Fathi et al.,1997) جزو تحمل پسابیدگی می‏باشند. در برخی از گونه‌های گیاهی آسیب ناشی از گرما یا خشکی تنش  اکسیداتیو را تحریک می‌کند که منجر به تولید و انباشته شدن انواع اکسیژن سمی نظیر رادیکالهای سوپراکسید، آب اکسیژنه و رادیکالهای هیدروکسیل می‌شود. گونه های فعال اکسیژن که در طی تنش تولید می‌شود می‌تواند به برخی از ترکیبات سلولی نظیر لیپیدها، کربوهیدراتها، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک آسیب برساند. تنش اکسیداتیو می‌تواند منجر به ممانعت فتوسنتز و فرآیند تنفس و رشد گیاه شود. گیاهان سیستم آنزیمی و غیر آنزیمی را در مقابله با انواع گونه های فعال اکسیژن ساخته‌اند(Tanaka et al., 1999). تجمع گونه های فعال اکسیژن(ROS) یکی از تغییرات بیوشیمیایی است که وقتی گیاهان در معرض تنش خشکی قرار می گیرند اتفاق می افتد(Pan et al., 2006).

سوپراکسید و هیدروژن پراکسید مولکول های سمی هستند و در اثر واکنش با اجزای کلروپلاست می‏توانند حتی تولیدات اکسیژنی با میل ترکیبی بیشتر نظیر رادیکال هیدروکسیل (^.OH) و اکسیژن نوزاد(O₂) تشکیل دهند(Casimir Brou et al.,2007; Lai et al., 2007; Valentovic et al., 2006;Yong et al., 2006). این ROS ها سم سلولی هستند(Badawi et al.,2004). تنش اکسیداتیو ناشی از تولید و تجمع گونه های سمی اکسیژن بوسیله محققین دیگر نیز گزارش شده است(Foyer and Noctor.2001). محققین زیادی گزارش کردند که در شرایط تنش خشکی فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانتی همچون گلوتاتیون پراکسیداز(Habibi et al.,2004) ، کاتالاز (Habibi et al.,2004; Serpil and Ozlem Cekie,2005  Kellos et al.,2008 ; ) سوپراکسید دیسموتاز (Habibi et al.,2004; Serpil and Ozlem Cekie,2005 ;Kellos et al.,2008 ; ) افزایش می یابد.

آنزیم‏های آنتی اکسیدانت کنترل کننده وضعیت سطوح متعادل گونه های فعال اکسیژن و نیتروژن(‏,ROS‏ (RNS‏بوده، به آنها انجام نقش‏های مهم در جایگاههای مخصوص، شرایط‏های محیطی و یا مراحل رشد و نمو در گیاهان را می‏دهد. اگرچه آنتی اکسیدانت‏ها دارای نقش‏های متعددی در فرایندهای مختلف فیزیولوژیکی در گیاه دارند. در نتیجه فعل و انفعالات مولکولی پیچیده و مستمر بین باکتری و گیاه، مقدار زیادی ROS‏ و احتمالاً RNS، در طول زمان زندگی گره‏ها تولید می‏شود ، از این رو یک نقش مهم آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت در هر دو سوی همزیستی انتظار می‏رود(Matamoros et al.,2003).

  سوپراکسید دسموتاز ریزوبیوم یک نقش مهم در آلودگی، تثبیت نیتروژن و به تأخیر انداختن پیری برگ دارد(Santos et al. 2000) و اسکونج کننده رادیکال‏های سوپر اکسید بوده، پراکسید هیدروژن تولید کرده که بوسیله کاتالاز و پراکسیداز تخریب می‏شود. کاتالاز فعالانه در گره‏ها و ریزوبیوم‏های آزاد‏زی یافت می‏شود و در گره‏سازی و تثبیت نیتروژن نقش دارد(Francis and Alexander 1972, Sigaud et al., 1999, Jamet et al., 2003). پراکسیداز‏ها نقش وسیعی در گره‏ها دارند((Matamoros et al., 2003. ماتاموروس و همکاران (Matamoros et al., 2003)  اهمیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانت در حمایت از همزیستی، به خصوص تحت شرایط استرس نشان دادند.

  لذا انجام تحقیق حاضر با توجه به اهمیت کشت مخلوط و  نیز توجه به اینکه تنش خشکی در حال و آینده مهمترین چالش پیش روی تولید محصولات کشاورزی به خصوص در کشورهای در حال توسعه خواهد بود ضروری به نظر رسید. در این تحقیق با توجه به پژوهش های انجام گرفته در زمینه کشت مخلوط دو گیاه خلر و جو انتخاب و در ترکیبات مختلف مورد بررسی قرار گرفتند.

مواد و روش ها

این آزمایش در فصل زراعی سال 1387-1386 در ایستگاه تحقیقات کشاورزی استان زنجان (خیرآباد) و ایستگاه تحقیقات دیم خدابنده انجام گرفت. محل اجرای آزمایش در شرایط آبی در ایستگاه خیر آباد به طول 48 درجه و 47 دقیقه‌ی شرقی و عرض 36 درجه و 31 دقیقه شمالی واقع شده است . ارتفاع آن از سطح دریا در محل اجرای آزمایش 1770 متر می‌باشد. محل اجرای آزمایش شرایط دیم در ایستگاه دیم خدابنده در طول 48 درجه و 49 دقیقه‌ی شرقی و عرض 36 درجه و 9 دقیقه شمالی واقع شده است و ارتفاع از سطح دریا در این محل 1875 متر می باشد.

 در این آزمایش  جو از خانواده گرامینه و خلر از خانواده لگومینوز با روش کاشت درهم و نسبت های مختلف بذر دو گیاه همزمان به صورت خالص و مخلوط کشت گردیدند. در این آزمایش برای بدست آوردن ترکیبات مورد نظر از روش جایگزینی استفاده گردید. در این روش نسبت معینی از گیاهان یک گونه حذف و معادل گیاهی آن از گونه دوم جایگزین می گردد(Mazaheri, 1994).  تیمارها عبارت بودند از:

1- کشت خالص جو(Hordeum vulgareL)  2- کشت خالص خلر (Lathyrus sativus)  3- نسبت 75 درصد خلر،25 درصد جو 4- نسبت 50 درصد خلر،50 درصد جو 5- نسبت 25 درصد خلر،75 درصد جو .

کشت به صورت پاییزه و در چهار تکرارانجام شد. تراکم جو 350 بوته در مترمربع و خلر 250 بوته در متر مربع در نظر گرفته شد. جهت آماده سازی زمین برای شخم از گاوآهن قلمی به عمق 25 سانتی متر استفاده و سپس توسط دیسک(هرس بشقابی) زمین جهت کشت آماده گردید. ابعاد هر کرت 5×3 تعیین شد. کاشت  در 28 آبان ماه و به صورت دستی صورت گرفت. با توجه به آزمایش خاک ، مقدار 46 کیلوگرم در هکتار کود فسفر(p₂o₅) از منبع سوپرفسفات تریپل(46درصد) قبل ازکاشت در زمین پخش گردید. در بهار مقدار 23 کیلوگرم کود نیتروژن از منبع اوره به صورت سرک به کلیه تیمارها داده شد. در شرایط آبی اولین آبیاری  بعد از اتمام فصل یخبندان  و در بهار در تاریخ 25 فروردین انجام گرفت و بعد از آن بر اساس نیاز فیزیولوژیک تا زمان برداشت ادامه یافت.

جهت اندازه گیری نیتروژن، از هر گیاه (خلر و جو) در نسبت های مختلف کشت شده، نمونه برداری و در آزمایشگاه میزان نیتروژن به روش کجلدال  (kjeldhal)محاسبه گردید(Walling et al.,1989). اندازه گیری ازت از عصاره حاصل از هضم تر(مرطوب) طی سه مرحله هضم، تقطیر، تیتراسیون با دستگاه اتوماتیک کجلدال انجام گردید.10 سی سی از عصاره گیاهی را درون لوله های هضم ریخته و عمل تقطیر در حضور سود غلیظ انجام شد. ازت به شکل آمونیوم داخل اسید بوریک 2 درصد جمع آوری و در حضور معرف شیمیایی بروموکروزوگرین متیل رد با اسید سولفوریک رقیق تیتر  گردید. خاتمه تیتراسیون با ظهور رنگ قرمز بود. از حجم مصرفی اسید در هر نمونه تیترانت مربوط به شاهد را کم کرده و عدد بدست آمده را در یک ضریب ثابت کاربردی آزمایش ضرب کرده که این ضریب به شرایط کار در آزمایش بستگی دارد.

جهت محاسبة آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز(GPX) و کاتالاز((CAT از روش پاگلیا(Paglia,1997) میزان تغییرات آنزیم تعیین گردید . میزان فعالیت آنزیم سوپر اکسید دسموتاز (SOD) توسط روش (Misra and Fridovich,1972 ) تعیین شد . سنجش  دی هیدروکسی گوانوزین8-OH-dG براساس روش(Bogdanov and Bical,1999) انحام شد. سنجش مالون دی آلدهید (MDA) و دی تیروزین (Di-Ty) بر اساس روش(Steven and Josef,1978) تعیین گردید.

بمنظور اندازه گیری کلروفیل برگ ابتدا مقدار 5/0 گرم برگ تازه گیاه با قیچی خرد شد و با استفاده از حدود 5 میلی لیتر آب مقطر در هاون چینی کاملاً سائیده گردید تا توده یکنواختی بدست آید. مخلوط حاصل در یک بالن ژوژه ریخته و با آب مقطر به حجم 25 میلی لیتر رسانده شد. مقدار 5/0 میلی لیتر از عصاره نمونه حاصل برداشته و با 5/4 میلی لیتر استون 80 درصد مخلوط گردید. سپس محلول حاصل به مدت 10 دقیقه در 3000 دور سانتریفوژ گردید. پس از سانتریفوژ کردن، محلول روئی جدا شده و میزان جذب نوری آن با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر(Milton Roy-model 21D) در طول موج 663 و 645 نانومتر قرائت شد و غلظت کلروفیل آن ها بر اساس روابط زیر تعیین گردید(Arnon,1994 ؛  Ashraf et al.,1994) .

میلی گرم کلروفیل a در هر گرم وزن تر:

5/0 میلی لیتر حجم نمونه استخراج شده´{(جذب در 645 نانومتر)69/2–(جذب در 663 نانومتر)7/12

میلی گرم کلروفیل b در هر گرم وزن تر:

5/0 میلی لیتر حجم نمونه استخراج شده´{( جذب در 663 نانومتر)69/4–(جذب در 645 نانومتر)9/22‍‍‍‍}

تجزیه و تحلیل نتایج دو ساله صفات با استفاده از نرم افزارSAS صورت گرفت و تجزیه واریانس مرکب برای دو محیط انجام و میانگین ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5 در صد مقایسه شدند.

نتایج:

با توجه به جدول تجزیه واریانس (جدول1و3) مشاهده شد که در خلر و جو بین محیط  های مختلف آزمایش  (آبی و دیم) و در نسبت های خالص و مخلوط از نظر آنزیم ها(GPX،CAT،SOD) و بیومارکرها(8-OH-DG،Di-Ty،MDA)، میزان هدایت الکتریکی‏، محتوای آب نسبی، کلروفیل اختلاف معنی داری وجود داشت. جدول 2و4 نشان می دهد که میزان تولید بیومارکرها و فعالیت آنزیم ها در شرایط دیم بیشتر از آبی بود و تفاوت معنی داری هم بین آنها وجود داشت. در خلر در شرایط دیم نسبت به آبی میزان GPX;CAT;SOD;8-OH-DG;Di-Ty;MDA به ترتیب 38/19 ،53/2 ،25/10 ،44/12 ،30/15 ،30/16  درصد افزایش یافت. در جو در شرایط دیم نسبت به آبی مقدار GPX;CAT;SOD;8-OH-DG;Di-Ty;MDA به ترتیب 35/25 ، 56/22 ، 92/9 ،  12/18 ،74/8 ،82/22 درصد افزایش یافته است. در مورد میزان فعالیت آنزیم ها و بیو مارکرها در کشت خالص و مخلوط مشاهده شد که میزان فعالیت آنزیم ها در کشت خالص خلر بیشترین و تولید بیومارکرها کمترین مقدار را داشت و بالعکس میزان فعالیت آنزیم ها در نسبت 25 درصد جو بیشترین  و تولید بیومارکرها کمترین بود.

همچنین مشاهده شد که درصد نیتروژن  خلر و جو در شرایط آبی بیشتر از دیم بوده و تفاوت معنی دار هم وجود داشت(جدول2و4). درصد نیتروژن خلر در شرایط دیم نسبت به آبی18/9 درصد کاهش یافت. بیشترین درصد نیتروژن در کشت خالص خلرb1 و کمترین درصد آن در نسبت 25 درصد خلر یا همان  b4 بود به طوریکه با کاهش نسبت خلر میزان درصد این عنصر نیز کاهش یافت(جدول2). درصد نیتروژن جو در شرایط دیم نسبت به آبی 5/12 درصد کاهش یافت. کمترین درصد نیتروژن در کشت خالص جو و بیشترین درصد آن در نسبت 25 درصد یا همان b4 بود. به طوریکه با افزایش نسبت جو میزان درصد این عناصر نیز کاهش یافته و نسبت های b3,b4  از نظر درصد نیتروژن در گیاه جو اختلاف معنی داری نداشت(جدول4).

جدول مقایسه میانگین2و4 نشان می‏دهد که میزان محتوای آب نسبی، کلروفیل خلر و جو در شرایط آبی بیشتر از دیم بوده و تفاوت معنی‏دار هم وجود داشت. برعکس میزان هدایت الکتریکی در شرایط دیم بیشتر از آبی بود. در گیاه خلر محتوای آب نسبی، کلروفیل a و کلروفیل b در شرایط دیم نسبت به آبی به ترتیب91/29 ،  09/17 ، 58/19 در‏صد کاهش یافت. بیشترین میزان محتوای آب نسبی، کلروفیل‏a و کلروفیل‏b در کشت خالص خلر(b1 ) بود و کمترین درصد آن در نسبت 25 درصد یا همان  b4بوده به طوریکه با کاهش نسبت خلر میزان این صفات نیز کاهش یافت. برعکس میزان هدایت الکتریکی در نسبت‏b4‏ بیشترین بود(جدول2). در جو محتوای آب نسبی، کلروفیل‏a و کلروفیل‏b در شرایط دیم نسبت به آبی به ترتیب54/24 ،53/11 ، 71/35 در‏صد کاهش یافت. کمترین میزان محتوای آب نسبی، کلروفیل‏a و کلروفیل‏b در کشت خالص جوb1 مشاهده شد و بیشترین درصد آن در نسبت 25 درصد  یا همان  b4بود به طوریکه با افزایش نسبت جو میزان این صفات نیز کاهش یافت. برعکس میزان هدایت الکتریکی در نسبتb4  کمترین بود. در جو میزان کلروفیل‏a و کلروفیل‏b در نسبت‏های b1 ، b2 تفاوت معنی‏داری نداشتند(جدول4).

بحث:

با توجه به نتایج حاصل از اندازه‏گیری  صفات فوق مشخص شد که درصد نیتروژن، محتوای آب نسبی، کلروفیل در شرایط آبی بیشتر از دیم بود. این نتیجه با نتایج حاصله توسط(Kazemi nasab et al.,2005) ؛ (Phazeli et al.,2005) مبنی بر کاهش کلروفیل در شرایط تنش خشکی مطابقت می‌کند. مسلماً کاهش میزان کلروفیل در شرایط تنش بدلیل تخریب کلروپلاست در این شرایط و کاهش ساخت رنگیزه ها می‏باشد. گزارشاتی مبنی بر کاهش کلروفیل در شرایط تنش خشکی وجود دارد(Mayoral and et al.,1981؛ Kuroda et al.,1990؛ Majumdar et al.,1991). همچنین‏ کاهش محتوای آب نسبی در هنگام تنش خشکی را به دلیل کمبود آب داخل برگهای گیاه تحت تنش ذکر می نمایند(Santiago et al.,2000).

نتایج حاصله از افزایش هدایت الکتریکی در شرایط دیم با نتایج بدست آمده از تحقیقات (Kazemi nasab et al.,2005) بر روی ذرت( Rafiei et al.,2005) بر روی آفتابگردان روغنی مطابقت دارد، ایشان معتقدند کمبود آب و تنظیم پتانسیل اسمزی برگ با ذخیره املاح و یون‏های معدنی و اسیدهای آلی و مواد قندی و رنگیزه های محلول در آب همراه است که تجمع این ترکیبات نوعی مقابله با کمبود آب را در گیاه القاء می‌نماید که سبب افزایش هدایت الکتریکی  و کاهش مقاومت غشاء سیتوپلاسمی می‌شود.

گیاهان در کشت خالص و نسبت‏های مختلف آنها در کشت مخلوط‏، از نظر درصد نیتروژن‏، محتوای آب نسبی‏، کلروفیل، مقاومت غشاء سلولی، اختلاف معنی‏داری با هم نشان دادند. در کشت خالص خلر از خانواده گیاهان لگومینوز که باکتری های تثبیت کننده نیتروژن در تراکم بیشتر افزایش می‏یابد میزان این صفات بیشتر از تراکم های کمتر این گیاهان بود. بالعکس در گیاهان خانواده گرامینه از قبیل جو در نسبت‏های کمتر این گیاهان که با نسبت بیشتر گیاهان خلر همراه بود میزان این صفات افزایش بیشتری نشان دادند و بالعکس میزان هدایت الکتریکی کمتری داشتند. تأثیر مثبت باکتری های  تثبیت کننده روی رشد و عملکرد توسط( Gholami et al.,2009 ؛Maunuksela, 2001; Nelson, 2004) نیز گزارش شده است. تلقیح با قارچ میکوریزا Glomus intraradices و  Pseudomonas straita  و ریزوبیوم باعث افزایش معنی‏دار در رشد گیاه و تعداد غلاف‏، محتوی کلروفیل‏، نیتروژن، فسفر و پتاسیم در نخود شد(Sayeed Akhtar and Siddiqui, 2008). همچنین تلقیح لوبیا با ریزوبیوم باعث افزایش محتوی کلروفیل، تعداد گره و وزن تر گره شد(Rajenran, et al., 2008) در گیاه سویا محتوی کلروفیل برگ به طور معنی‏داری با تجمع نیتروژن در گیاه ارتباط داشت(Mirza et al.,1990)

زمانی که تنش اکسیداتیو ایجاد می شود، ‌رادیکال های آزاد باعث تخریب پروتئین ها شده،  اسیدهای آمینه مختلف آزاد می شوند و از اتصال دو اسید آمینه تیروزین از محل اکسیژن هایشان یک دی پپتید بنام        دی تیروزین ایجاد می گردد که این ماده نشانه ای از حمله رادیکال های آزاد در هنگام تنش خشکی به پروتئین ها و تخریب آنها می باشد. در واقع در هنگام تنش با توجه به اینکه میزان رادیکال های آزاد اکسیژن بیشتر می ‌شود، پروتئین ها بیشتر در معرض تخریب قرار گرفته و میزان تولید دی تیروزین نیز بالا می‌رود از اندازه گیری میزان تولید این ماده می توان به این نکته پی برد که تنش اکسیداتیو افزایش یافته است.در شرایط تنش و با تشکیل رادیکال های آزاد که منجر به صدمات و نابودی سلولها می شود میزان تخریب لیپیدها بیشتر شده و تولید MDA نیز افزایش می یابد. در اثر تنش خشکی با افزایش رادیکال های آزاد سطح تولید و ترشح دی هیدروکسی گوآنوزین اضافه شده و تخریب DNA و جهش و اثرات ژنتیکی کشنده دیگر بیشتر می‌شود.

بدین ترتیب همانطور که ملاحظه شد میزان تولید بیومارکرها  و فعالیت آنزیم ها در کشت دیم بیشتر از آبی بوده و به همین دلیل است که در شرایط تنش آسیب به گیاه وارد شده و میزان بیومارکرها افزایش یافته و بدنبال آن گیاه برای مقابله با تنش فعالیت آنزیم ها را افزایش داده است. این نتایج با نتایج جوز و همکاران    ( Jose et al.,1999)  و جین و همکاران (Jin et al., 2006)  مبنی بر افزایش آنزیم ها و تولید بیومارکرها در شرایط تنش خشکی همسو است. در واقع هنگام افزایش سطح رادیکال های آزاد اکسیژن این رادیکال ها در DNA اثرات تخریبی خود را انجام داده و بررسی این اثرات تخریبی نشان می دهد که اسکلت قندی و بازهای نولکئوتیدی DNA هر دو به اکسیداسیون حساس بوده و این به دلیل تجزیه بازی، شکستگی حلقه منفرد و اتصال به پروتئین است، تجزیه بازی، محصولات فراوانی نظیر 8- هیدروکسی گوآنوزین را تولید می نماید، این ماده از شیرة هسته ترشح و به سمت سیتوپلاسم حرکت و اثرات تخریبی خود را ظاهر می نماید. آنها معتقدند با دسترسی آب و کاهش تنش میزان سطح رادیکال های آزاد اکسیژن کاهش می یابد و در نتیجه تخریب حاصله نیز کاهش می یابد.

آزمایشات صورت گرفته  توسط(Saei et al.,2005) بر روی سورگوم علوفه ای نشان می دهد که فعالیت آنزیم  های آنتی اکسیدانت در شرایط تنش خشکی نسبت به شرایط نرمال بیشتر می‌شود، پس از این آنزیم ها می‌توان جهت تعیین گونه های مقاوم به خشکی استفاده نمود . افزایش فعالیت این آنزیم ها در تیمار تنش به خاطر نقش مهم این آنزیم ها جهت مقابله با رادیکالهای آزاد اکسیژن ایجاد شده در اثر تنش خشکی می‌باشد. بنابراین SOD به عنوان یکی از اجزای مهم مکانیسم دفاعی گیاه در نظر گرفته می‌شود. از جمله آنزیم های مهم که در مقابله تنش های محیطی نقش مهمی را ایفا می‌نماید، گلوتاتیون پراکسیداز می باشد که کاهش پراکسید هیدروژن را با استفاده از گلوتاتیون احیا شده (GSH) کاتالیز می‌کند و بدین وسیله از سلولها در برابر آسیب‏های ناشی از اکسایش حفاظت می‌کند( Ghorbani ghojdi and Ladan Moghadam,2005).گروهی از محققین هم گزارش کردند که افزایش فعالیت کاتالاز جهت کاهش اثر پراکسید هیدروژن در هنگام تنش های محیطی در گیاهان گندم ، جو ، سویا و نخود نقش مهمی دارد(Kendall and McKersie(1989) ; Basra(2001) and  Basra) .

میزان فعالیت آنزیم های خلر در کشت مخلوط به طور معنی داری کمتر از کشت خالص بود. در واقع با کاهش تراکم از نسبت خالص 100درصد به نسبت مخلوط ها(75، 50، 25) میزان فعالیت آنزیم ها نیز کاهش یافته است و بالعکس میزان بیومارکرها افزایش یافته است. در کشت خالص جو نسبت به مخلوط ها کمترین میزان فعالیت آنزیم و بیشترین تولید بیومارکر را داشت. پس در واقع می توان گفت در کشت خالص جو به گیاه خسارت بیشتری نسبت به زمانیکه آن مخلوط با گیاه لگوم کشت شده اند وارد آمده است. برعکس در کشت خالص خلر میزان فعالیت آنزیم ها بیشتر و تولید بیومارکرها نسبت به زمانیکه آن به صورت مخلوط با گیاه دیگر کشت شده اند کمتر بود. زیرا گیاهان خانواده لگوم باکتری های تثبیت کننده نیتروژن داشته و زمانیکه تراکم این گیاهان بیشتر است باکتری های تثبیت کننده بیشتر بوده و لزوم تثبیت نیتروژن بیشتر باعث افزایش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانت می شود. 

به نظر می رسد یکی از دلایل افزایش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانت در نسبت های کشت  مخلوط با نسبت بالای لگوم، وجود باکتری های ریزوبیوم و تأثیر این باکتری ها در افزایش رادیکال های آزاد اکسیژن باشد. لذا برای تثبیت نیتروژن در طول دوره گره سازی و از بین بردن رادیکال های آزاد اکسیژن، فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانت افزایش یافته و در نتیجه تولید بیومارکرها کاهش یافته است. خلر از خانواده گیاهان لگومینوز که باکتری های تثبیت کننده نیتروژن در تراکم بیشتر افزایش می یابد، بنابراین در صد نیتروژن بیشتر از تراکم های کمتر این گیاهان بود. بالعکس در گیاهان خانواده گرامینه از قبیل جو در نسبت های کمتر این گیاهان که با نسبت بیشتر گیاه خلر همراه بود میزان درصد نیتروژن افزایش بیشتری نشان داد. تأثیر مثبت باکتری های تثبیت کننده نیتروژن روی رشد و عملکرد در ذرت توسط(Gholami et al.,2009; Maunuksela, 2001; Nelson, 2004) نیز گزارش شده است.

جدول 1

جدول 3- 4-----------