Study on the effects of time and concentration of colchicine treatment in doubled haploidrice production

مقدمه

 برنج، یکی ازمنابع عمده غذایی است که بیش از نیمی از جمعیت جهان از نظر تامین کالری وپروتئین به آن وابسته اند. خصوصا در بین کشور‌های آسیایی که بیش از 50 درصد از کالری مورد نیاز روزانه آنها از برنج تامین می‌گردد [Bajaj,1991]. با توجه به روند رو به افزایش جمعیت جهان، طبق آمارهای سازمان خواروبار جهانی( فائو) تا سال 2025 میزان 760 میلیون تن شلتوک نیاز خواهد بود تا بتوان میزان تقاضای جمعیت جهان را به این منبع مهم غذایی تامین نمود و این در حالی است که بیشتر زمین‌های زراعی مورد بهره برداری قرار گرفته است. بوی‍ژه در آسیا که بیش از 90درصد از برنج جهان تولید و مصرف می‌شود [2004 Kush,]. بنابراین، افزایش تولید برنج در آینده، نیاز به بهبود راندمان تولید وابداع تکنولوژی‌های جدیدتری دارد. روش‌های کشت بافت برنج، می تواند در اصلاح وتولید واریته‌هایی با عملکرد بالا و مقاوم به آفات وبیماری‌هاکمک نماید [Zapata, 1984]. کشت بافت گیاهی، فرآیندی است که در آن قطعات کوچکی از بافت زنده از گیاه جدا ودر یک محیط مغذی رشد داده میشود. کشت بافت گیاهی یا کشت گندزدایی شده سلولها، بافت‌ها و اندام‌ها تحت شرایط فیزیکی و شیمیایی معین در شرایط درون شیشه ابزاری مهم در مطالعات پایه وکاربردی میباشد. این تکنیک مهم، مرهون نظریات دانشمند آلمانی هابرلانت در آغاز قرن بیستم است [Trevor and Thrope,2007]. یکی ازکاربرد‌های کشت بافت، تولیدگیاهان هاپلویید است. مهمترین روش‌های تولید گیاهان هاپلویید در محیط درون شیشه ای شامل کشت بساک، کشت دانه گرده جدا شده و کشت تخمک می باشد. کشت بساک رایج‌ترین شکل کشت گرده است که بساک‌ها در مرحله نموی تک هسته‌ای انتخاب میشوند. [Bahar, etal. 2008]. تولید گیاهان هاپلویید در برنج با استفاده از کشت بساک اولین بار توسط اونو و نیزیکی در سال1968 انجام شد. [Niizeki and Oono, 1968] تکنیک‌های کشت بساک در برنامه‌های اصلاحی برنج اهمیت بسیاری دارد. چون موجب افزایش کارآیی انتخاب شده، دوره اصلاحی را تسریع نموده وامکان تولید سریع تر وانتخاب لاین های موتانت مفید تری را در برنامه‌های اصلاحی موتاسیونی میدهد. بدلیل اینکه این تکنیک‌ها در بر گیرنده گامت ‌های هاپلویید)دانه‌های گرده( بجای والدین دیپلویید است، تعداد گیاهان لازم جهت بیان باز ترکیب‌های مختلف، کمتر از روش‌های سنتی است.[Guey,2010] تولید گیاهان هاپلویید ودوبرابر نمودن مجموعه کروموزومی(ژنوم) آنها به ایجاد گیاهان دابلد هاپلویید منجر میگردد. این روش، سریعترین روش برای دستیابی به لاین‌های صد در صد خالص) اینبرد لاین) میباشد [Zapata, 1984. Talebi etal.,2007.].

 کلشی سین، مهمترین عامل شیمیایی، جهت دوبرابر کردن کروموزوم‌ها می باشدکه در سطح وسیعی بکار می‌رود[Ryopy,1997.,Burun2008.Segui-Simarro and Nuez,2008]. کلشی سین، باز دارنده رشته‌های دوکی شکل وعمل کننده در سلول‌های در حال تقسیم گیاهان میباشدکه از تشکیل میکروتوبول‌ها، از طریق پیوند با زیر واحد پروتئینی میکروتوبولی‌ (توبولین) ممانعت میکند. لذاکروموزومها در مرحله متافاز، یک جا وارد یک سلول میگردند. در نتیجه تعداد کروموزوم سلول حاصل از تقسیم دو برابر میگردد Nitch andKasha,1975]].

    این مطلب که گیاهان حاصل ازکشت بساک و دانه گرده، درجات پلوییدی متفاوتی مانند x،x2x,3x,4و x5دارند بخوبی شناخته شده است. ولی بیشتر آنها هاپلویید ودیپلویید هستند. طبق گزارش هوآنگ وهمکاران )1978( از 2496 مجموعه از گیاهان باززایی شده از گرده،3/35 درصد هاپلویید و4/53درصد دیپلویید بودند. ین وهمکاران (1976)وچن ولی(1978) با توجه به مشاهدات خود،فراوانی دیپلویید‌هارادر گیاهان حاصل از گرده، بیش از 50 درصد گزارش نمودند. تجزیه ژنتیکی نشان داد که بیش از 90 درصد نتاج دیپلویید حاصل ازدورگه‌ها هموزیگوس بودند. بنابر این می‌توان چنین نتیجه گرفت که گیاهان دیپلویید، بصورت خود بخودی در محیط کشت دوبرابر شده‌اند و از سلولهای سوماتیکی دیواره بساک مشتق نشده‌اند. دوبرابر شدن کروموزومها با غوطه ور کردن ریشه‌ها وگره‌های واجد پنجه در محلول مایع 2/0 درصد کلشی سین و1/0درصد فومیرون افزایش می‌یابد [etal.,1976Chen and Lee1978.,Yin].  ولی هاپلوییدها در محیط کشت کالوس‌زای سوماتیکی نیز دوبرابر میشوند. ما میدانیم که خوشه‌چه وبرگهای جوان هاپلویید برنج وقتی در یک محیط کشت دارای 2-4-D قرارداده شوندکالوس سوماتیکی تولید میکنند. پس درنتیجه اندومیتوز یا اندو دوپلیکیت سلول‌های کالوس تعدادی از گیاهان بایستی دوبرابرشوند[IRRI,1982]. ین وهمکاران غلظت 1/0 را بهترین غلظت برای تولید گیاهان دابلد هاپلوییداز تیمار گیا هچه های هاپلویید معرفی کردند[et al.,1976Yin]. همچنین با بررسی غلظت ها وزمان مختلف تیمار گیاهچه های هاپلوییدبا کلشی سین بهترین غلظت و زمان تیمار غلظت 1/0 و زمان 10 و 12 ساعت معرفی شده است[Shouyi and Shouyin,1991]. دراین تحقیق، به منظور تعیین بهترین غلظت کلشی‌سین و مدت زمان مناسب تیمار گیاهان هاپلویید جهت مضاعف شدن کروموزوم‌های آنها، بوته‌های هاپلوئید بدست آمده از کشت بساک دو هیبرید برنج با سه غلظت متفاوت از محلول کلشی‌سین با سه تیمار زمانی متفاوت مورد بررسی قرار گرفتند.

مواد وروش ها :

1-موادگیاهی:

 دو رقم هیبرید به نام هایGRH1 (دیلم)وIR69688H در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت.

  جهت کشت بساک و تولید گیاهان هاپلوییددر آزمایشگاه کشت بافت در موسسه تحقیقات برنج کشورعملیات مربوط به کاشت دو رقم هیبرید ازبهارسال 1386 آغاز گردید . این عملیات در مزارع تحقیقاتی واقع در موسسه تحقیقات برنجکشور واقع در رشت صورت گرفت. کلیه عملیات خزانه گیری،  بذر پاشی، نشاءکاری طبق روش معمول در موسسه تحقیقات برنجصورت گرفت. در طول این مدت عملیات داشت، شامل وجین علف های هرز، کود پاشی، مبارزه با آفات وبیماری ها نیز طبق روش متداول انجام گرفت.  گیاهان هاپلوییدی که از کشت بساک دو رقم هیبریدGRH1 [دیلم] وIR69بدست آمده بودند در مزرعه پنجه های زیادی تولید کردند .تعداد 135 بوته از هر رقم برداشت و جهت اعمال تیمارهای مورد نظر به گلخانه انتقال یافت. بعد از برداشت بوته‌ها تعداد 10 پنجه از هر بوته جهت اعمال تیمار جدا گردید.پس از انتقال بوته‌های هاپلویید به گلخانه، ابتدا جهت پاک نمودن ریشه‌ها ازخاک، ریشه‌های هر بوته کاملا با آب شستشو و تمیز گردید سپس نوک ریشه‌های هر بوته توسط قیچی قطع گردید و سپس به منظور راتون‌دهی ساقه‌ها درارتفاع 15 سانتی متری از طوقه بریده شدند.جهت غوطه ور کردن گیاهچه های هاپلویید در محلول کلشی سین سه غلظت 05/0، 1/0 و 15/0 از این محلول تهیه گردید.اعمال تیمارهای کلشی سین بصورت آزمایش فاکتوریل با دو فاکتور (میزان غلظت درسه سطح(05/0، 1/0 و 15/0) و زمان (8، 12 و18 ساعت)در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار ودر هر تکرار 5 بوته انجام گرفت. جهت انجام بهتر ودقیق تر آزمایش بوته های مربوط به هر غلظت بطور جداگانه در یک روز برداشت وآماده تیمار شدند. بطور مثال ابتدا میزان محلول لازم برای غلظت05/0تهیه گردید.پس از ریختن محلول در ظرف مخصوص بوته های آماده شده برای این غلظت یعنی 45بوته از هیبرید GRH1 (5 بوته به ازاء هر تکرار ،سه تکرار وسه زمان مختلف) در داخل ظرف قرار داده شد. بعد از 8 ساعت بوته های مربوط به زمان اول یعنی 15 بوته برداشت گردید. بعد از 12 ساعت 15 بوته مربوط به زمان دوم وپس از 18 ساعت 15 بوته مربوط به زمان سوم برداشت شدند سپس 45 بوته مربوط به غلظت1/0 و بعد 45 بوته مربوط به غلظت 15/0 از هیبریدGRH1 به شرح فوق تیمار گردیدند سپس همین کار برای 135 بوته مربوط به هیبرید IR69 انجام گرفت^.بوته‌های تیمار‌شده با کلشی سین پس از اتمام زمان مقرر بمدت 24 ساعت در آب جاری قرار گرفت وسپس در گلدان ‌ها‌یی که محتوی خاک مزرعه بود کشت گردید. بوته‌های کاشته‌شده در گلدان به گلخانه منتقل شدند. ودر طی این مدت، کلیه مراقبت‌های زراعی مانند آبیاری، وجین علف‌های هرز، کود‌دهی(در صورت نیاز) ومبارزه با آفات وبیماری‌ها انجام گردید.صفاتی که در این تحقیق مورد مطالعه قرار گرفت عبارت بودند از 1- میانگین تعداد پنجه تولید شده در هر بوته2-متوسط تعداد پنجه دابل هاپلویید تولید شده در هر بوته 3- درصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید4-درصد بوته های دارای پنجه پلی پلویید5- درصد بوته های دارای هر دو نوع پنجه دابل هاپلویید و پلی پلویید6- متوسط تعداد بذور در هر خوشه. کلیه صفات مذکور  اندازه گیری شدند وداده ها ثبت گردیدند تجزیه وتحلیل داده ها با استفاده از نرم افزار MSTATC‍ انجام ومقایسه میانگین تیمار ها واثرات متقابل آنها بر صفات اندازه گیری شده بر اساس آزمون LSD انجام شد.

بحث ونتیجه گیری:

در این تحقیق شش صفت اندازه گیری و مورد ارزیابی قرار گرفت که نتایج مربوط به هرصفت بطور جداگانه ارائه و مورد بحث وبررسی قرار می گیرد.در صفات درصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید،درصد بوته های دارای پنجه پلی پلویید ودرصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید وپلی پلویید بدلیل نرمال نبودن داده هادر ابتدا تبدیل داده ها به صورتانجام شد وسپس تجزیه واریانس ومقایسات میانگین بر روی داده ها ی تبدیل شده صورت گرفت ولی در جداول مقایسه میانگین از میانگین های اصلی استفاده شد.

1-میانگین تعداد  پنجه تولید شده در هر بوته

تجزیه واریانس این صفت نشان دادکه تفاوت معنی داری بین دو واریته، سه غلظت مختلف کلشی سین و سه زمان متفاوت وجود داردکه این نشاندهنده متفاوت بودن دو رقم در صفت درصد پنجه زنی می‌باشد و از طرفی این صفت تحت تاثیر  غلظت وزمان تیمار کلشی‌سین نیز می‌باشد. اما اثر متقابل واریته در غلظت، واریته در زمان، غلظت درزمان و واریته در غلظت در زمان معنی‌دار نشده است (جدول1).

مقایسه میانگین واریته ها نشان داد که رقم دیلم(GRH1) بیشترین میزان پنجه تولید شده یعنی 933/7 پنجه  را در بین دو رقم داشته  است. همچنین با بررسی مقایسه میانگین غلظت ها برای این صفت،  بیشترین تعداد پنجه تولید شده در غلظت05/0 بدست آمد. در بررسی اثرات متقابل طبق نتایج تجزیه واریانس اثر متقابل بین واریته وغلظت معنی دار نگردید. معنی دار نشدن  اثر متقابل واریته بر غلظت نشاندهنده تاثیر مستقل این دو تیمار(واریته وغلظت) بر روی صفت مورد بررسی(تعداد پنجه) می باشد یا بعبارت دیگر این دو تیمار در صفت مورد بررسی فاقد اثر متقابل می باشند.

اثراصلی زمان بر روی صفت میزان تولید پنجه در سطح احتمال 1% معنی دار گردید(جدول1). بیشترین تعداد پنجه بدست آمده در 8 ساعت وپس از آن 12 و18 ساعت در کلاس های بعدی قرار می گیرند یا بعبارتی با افزایش زمان تیمار بوته ها میزان تولید پنجه در آنها کاهش می یابد که البته این امر طبیعی بنظر می رسد چرا که هرچه زمان تیمار بوته ها زیاد تر باشد آسیب بیشتری از لحاظ تنش غذایی، پلاسیده شدن بیشتر ریشه ها ویا حتی مرگ تعدادی از پنجه های اولیه  به بوته های تحت تیمار وارد می گرددکه این آسیب ها باعث ضعیف شدن بوته ها و در نهایت کاهش تعداد پنجه های بعدی آنها می گردد.اثر متقابل بین رقم وزمان معنی دار نیست.بدین معنی که مدت زمان تیمار بوته ها بطور مستقل از رقم بر روی صفت تعداد پنجه تاثیر داردیا به عبارتی تاثیر رقم و زمان بر روی صفت تعداد پنجه بطور موازی می باشد. جدول مقایسه میانگین اثر متقابل غلظت بر زمان  برای تعداد پنجه نشان می دهد که بیشترین میزان تولید پنجه در غلظت 05/0 وزمان 8 ساعت (900/8) و کمترین میا نگین تولید پنجه در غلظت 15/0 در 18 ساعت بود(600/6).

جداول 1-------------

2- متوسط تعداد پنجه دابل هاپلویید تولید شده در هر بوته

تجزیه واریانس صفت متوسط تعدادپنجه دابلد هاپلویید تولید شده نشان داد که بین ارقام مورد بررسی تفاوت معنی داری در سطح 05/0 وجود دارد(جدول1). متوسط تعداد پنجه دابل هاپلویید تولید شده در رقمGRH1(93/7)بطور معنی داری از رقم IR6988 (54/7)  بیشتر بود(جدول2).اثر اصلی زمان نیز برای این صفت معنی دار بود یا بعبارتی متوسط تعداد پنجه دابل هاپلویید تولید شده در هر بوته بطور کلی در تیمار های زمانی مختلف متفاوت بوده است . معنی دار شدن اثر اصلی غلظت بر روی این صفت نشان دهنده متفاوت بودن متوسط تعداد پنجه دابل هاپلویید تولید شده در هر بوته در تیمار های غلظتی مختلف می باشد. بر اساس نتایج تجزیه واریانس هیچ کدام از اثرهای متقابل دو گانه و سه گانه معنی دار نگردیده است. (جدول1). معنی دار نشدن اثر متقابل نشان دهنده تاثیر مستقل هر یک از تیمار ها بر روی متوسط تولید پنجه دابلد هاپلویید در هر بوته می باشد.یا بعبارتی اثر تیمار های مورد بررسی بر روی صفت مذکور بطورموازی ودرجهت ویادرخلاف جهت همدیگر بوده است.

جدوال 2-4----------------------------

نتایج مقایسه میانگین واریته ها، غلظت ها وزمان هاواثرات متقابل آنها بر هم در جداول ونمودار ها نشان داده شده است.مقایسه میانگین زمان های متفاوت برای این صفت نشان دادکه بیشترین میانگین در زمان 18 ساعت بوده(94/2پنجه دابل هاپلویید در هر بوته) که تفاوت معنی داری با زمان 8 ساعت(49/2پنجه دابل هاپلویید در هر بوته) داردکه دارای کمترین میانگین پنجه دابل هاپلویید بوده است(جدول4). همچنین مطالعه اثر متقابل واریته در زمان نشان داد که بیشترین میانگین تعداد پنجه دابل هاپلویید در رقمGRH1در12و18 ساعت(به ترتیب 84/2 و18/3) و کمترین آن در رقم IR6988در 8 ساعت(278/2) می باشد(جدول 5).

3- درصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید

تجزیه واریانس صفت درصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید نشان داد که اثر اصلی واریته، غلظت و زمان معنی دار می باشد در این صفت نیز همانند دو صفت قبلی اثر اصلی این صفت معنی دار گردید.که این معنی دار شدن نشان دهنده تفاوت معنی دار در اثرات اصلی هر سه تیمار اعمال شده می باشد اما از بین اثرهای متقابل فقط اثر متقابل زمان در غلظت معنی دار گردیده است یعنی این که اثر این دوفاکتور بر روی درصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید بطورموازی باعث کاهش یا افزایش این صفت نمی شوند. بهترین نتیجه را می توان در یک غلظت وزمان خاصی بدست آورد.نتایج مقایسه میانگین واریته ها نشان می دهد که بیشترین درصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید مربوط به رقم GRH1(333/53) می باشد که با درصد پنجه دابل هاپلویید در رقم IR69اختلاف معنی داری دارد.همچنین در بین سه غلظت بکار رفته در آزمایش موثر ترین غلظت بکار رفته جهت تولید بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید مربوط به غلظت های 1/0 و15/0(به ترتیب به میزان 333/53  و 778/57) می باشد که تفاوت معنی داری با غلظت 05/0(به میزان 778/37) دارد.با مقایسه میانگین زمان های مختلف مشخص شد که  بیشترین درصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید در زمان 12 ساعت(با مقدار889/86) وکمترین آن زمان 8 ساعت(667/36) بدست آمد. همچنین با بررسی مقایسه میانگین اثر متقابل واریته وزمان برای این صفت بیشترین مقدار آن مربوط به رقم GRH1 وIR6988 در تیمار زمانی 12 ساعت بود(بترتیب111/71 و667/66) و کمترین درصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید مربوط به رقم IR6988 در تیمار زمانی 8ساعت(به میزان333/33) بود. (جدول5)  با مقایسه میانگین  اثرات متقابل غلظت وزمان بر این صفت بیشترین میانگین درصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلوییددر زمان 12 ساعت و غلظت 1/0 (به مقدار 333/83) مشاهده شد که با کمترین مقدار آن در غلظت 05/0 وتیمار زمانی 8 ساعت(به میزان0/20) اختلاف معنی‌دار داشت (جدول6).

4- درصد بوته های دارای پنجه پلی پلویید

با تجزیه واریانس این  صفت، اثر اصلی واریته در سطح احتمال 5% واثرات اصلی غلظت وزمان در سطح احتمال 1% معنی دار گردیددر حالی که هیچ کدام ازاثرات متقابل تیمار ها معنی دار نگردید(جدول1) که این معنی دار نشدن همانند بعضی از صفات قبلی نشاندهنده تاثیر مستقل تیمار ها بر روی صفت درصد بوته های دارای پنجه پلی پلویید می باشد. بعضی تیمار های اعمال شده بطور موازی در یک راستا باعث کاهش یا افزایش صفت مذکور شده اند. رقمGRH1بطور میانگین دارای درصد پنجه پلی پلویید بیشتری(به میزان333/33) از رقمIR6988 (به میزان 704/23) بود(جدول 2). میانگین این دو رقم برای صفت مذکور با هم اختلاف معنی داری داشتند. با مقایسه سه تیمار غلظت اعمال شده مشاهده می شود که در غلظت 15/0کلشی سین بیشترین درصد بوته های دارای پنجه پلی پلویید وجود دارد(به میزان889/38) و در دوغلظت دیگرمقدار این صفت بطور معنی داری کمتر است(667/26 و000/20) (جدول3).زیاد بودن درصد پنجه پلی پلویید در غلظت 15/0 دور از انتظار نیست چرا که با افزایش غلظت کلشی سین احتمال جذب بیشتر کلشی سین و در نتیجه تولید بیشترپنجه های پلی پلویید افزایش می یابدکه البته این موضوع در تحقیقات قبلی از جمله ین وهمکاران(Yin etal,1977) ولیانگ شویی و هوآنگ شویین [1991Shouyi and Shouyi,] نیز به اثبات رسیده بود. با افزایش زمان تیمار نیز درصد بوته های دارای پنجه پلی پلویید افزایش یافت بطوری که در زمان 18 ساعت بیشترین درصد بوته های دارای پنجه پلی پلویید (به مقدار 556/45 درصد) و بعد از آن در زمان 12 ساعت (به مقدار 30 درصد) وسپس کمترین میزان نیز در زمان 8 ساعت (به مقدار10درصد) مشاهده گردید.  البته افزایش میزان درصد پلی پلوییدی با افزایش زمان تیمار امری کاملا طبیعی می باشد چرا که با افزایش مدت زمان تیمار میزان کلشی سین جذب شده توسط گیاه افزایش خواهد یافت و از طرفی هرچه گیاه مدت زمان زیادتری در معرض تیمار کلشی سین قرار داشته باشد سلول های مریستمی در حال تقسیم میتوز ممکن است که چندین تقسیم متوالی را در حضور کلشی سین انجام دهند وکلشی سین با مختل کردن رشته های دوک باعث بوجود آمدن سلول های مریستمی دارای چندین نسخه کامل ژنوم گردند و در نتیجه پنجه های پلی پلویید حاصل گردد. این موضوع یعنی افزایش درصد پنجه پلی پلویید بالطبع باعث کاهش درصد پنجه های دابل هاپلویید خواهد گردید. بطوری که با نگاهی به صفت درصد پنجه دابل هاپلوییدمتوجه می شویم که افزایش زمان از 12 به 18 ساعت موجب کاهش درصد بوته های دارای پنجه دابل هاپلویید شده است. محققینی نظیر لیانگ شویی وهوآنگ شویین[1991Shouyi and Shouyi,].و ین وهمکاران((Yin etal,1977)) اذعان کرده اند که با افزایش مدت زمان تیمار  باکلشی سین علاوه بر افزایش درصد پنجه های پلی پلویید باعث کاهش درصد پنجه های دابل هاپلویید نیز می شودبطوریکه لیانگ شویی در تحقیقات خود اعلام داشت که در مدت زمان 12 ساعت بیشترین درصد پنجه دابل هاپلویید بدست آمدو با افزایش زمان به 18 و24 ساعت میزان درصد دابل هاپلویید به طور معنی داری کاهش یافت. مقایسه میانگین اثر متقابل واریته و زمان برای این صفت نشان داد که بیشترین مقدار آن در واریتهGRH1و زمان 18 ساعت(به میزان 33/53) مشاهده شد که با  کمترین مقدار  آن در واریته IR69 در زمان 8 ساعت و واریته GRH1 در زمان 8 ساعت(بترتیب667/6 و333/13) اختلاف معنی‌دار داشت(جدول5).

5-درصد بوته های دارای پنجه دابلهاپلویید و پلی پلویید

با تجزیه واریانس این صفت مشخص گردید که فقط اثر اصلی زمان در سطح 1% معنی دار می باشد و سایر اثرهای اصلی و متقابل برای صفت درصد بوته های دارای هر دو پنجه دابل هاپلویید وپلی پلویید معنی دار نیست(جدول1). بنابراین میانگین درصد بوته های دارای هر دو پنجه برای هر دو رقم از نظر آماری یکسان بوده است(جدول2  ).  با بررسی مقایسه میانگین تیمار های زمانی مختلف مشخص شد که بیشترین درصد بوته های دارای هر دونوع پنجه در زمان 18 و12 ساعت (بترتیب444/14 و000/10) وکمترین آن در زمان 8 ساعت(0) مشاهده شد (جدول 4). البته صفر بودن این صفت در زمان 8 ساعت بدین معنی است که میزان جذب کلشی سین و یا بعبارتی در معرض کلشی سین قرار گرفتن سلول های مریستمی به اندازه ای نبوده است که سلول های مریستمی بتوانند چندین تقسیم میتوز را در حضور کلشی سین انجام دهندتا منجر به تولید سلول های حاوی چندین کپی از ژنوم کامل برنج باشند.

6- متوسط تعداد بذور در هر خوشه

تجزیه واریانس این صفت نشان داد که متوسط تعداد بذور در هر خوشه فقط برای اثر متقابل غلظت در زمان معنی دار گردید و سایر اثرهای اصلی و متقابل برای این صفت معنی دار نگردید ( جدول1). بنابر این میانگین تعداد بذور در هر خوشه برای دو واریته از نظر آماری یکسان بود ( جدول2). بیشترین میانگین تعداد بذور در خوشه در واریته IR69 و زمان 18 ساعت (به میزان 95/37) و کمترین آن در رقم GRH1 و زمان 12 ساعت ( به میزان 9/31) بود ( جدول 5). با بررسی اثر متقابل غلظت در زمان مشخص گردید که در غلظت 05/0 و زمان 18 ساعت(249/38)  و در غلظت 1/0 وزمان 8 و18 ساعت(به ترتیب963/37 و517/36) بیشترین متوسط تعداد بذور در هر خوشه ودر زمان 8 ساعت و غلظت 05/0 کمترین مقدار این صفت(045/29)مشاهده گردید(جدول6).در این تحقیق به ازای  هر خوشه بذر کمی در مقایسه با خوشه‌های برنج در حالت طبیعی تولید گردید بدلیل اینکه خوشه های باردار خوشه اصلی نبوده ودر واقع راتون می باشند وهمانطوری که در تحقیقات مختلف نشان داده شده است که میزان بذر در  راتون بسیار کمتر از خوشه اصلی می باشد همچنین بوته ها بعد از تیمار کلشی سین به علت استرس وارده رشد کمتری دارند و اینکه بوته ها در شرایط گلخانه ای رشد کرده اندکه در شرایط گلخانه ای رشد بوته ها کمتربود وبنابر این پنجه ها وراتون های ضعیف تری تولید کردندکه منجر به تولید بذر کمی در خوشه گردید.