مقدمه

به­نظر می­رسد که در حال حاضر استفاده از گیاهان خانواده بقولات در سیستم­های کشاورزی با نهاده و هزینه اندک، امری ضروری است. از آن­جا که به­واسطه توانایی بالقوه تثبیت نیتروژن این گیاهان (Peoples et al., 2009) و افزودن کربن آلی به خاک (Zhang, Wang, Wang, Wang, & Han, 2009)، نقش آن­ها در توسعه کشاورزی اجتناب­ناپذیر است (Abberton, 2010). یونجه­های یک­ساله نیز با دارا بودن این توانائی و با توجه به ویژگی خاص خود در تجدید حیات (قابل نفوذ شدن تدریجی پوسته­های سخت بذر)، در میان لگوم­های یک­ساله، بیش­تر مورد توجه هستند. وجود پوسته سخت بذر در گیاهان خانواده بقولات عامل اصلی خواب بذر محسوب می­شود (Heydari Sharif Abad & Torknejad, 2000). عدم نفوذ­پذیری گیاهان این خانواده نسبت به آب، نتیجه دو عامل است: 1) وجود پوسته بذر که دارای یک لایه سخت و سلول­های اپیدرمی محکم بوده؛ که به­صورت عمود بر پوسته بذر قرار گرفته؛ و نیز وجود ترکیب­های فنلی با مواد آب­گریز 2) بسته شدن منافذ طبیعی پوسته بذر شامل سوراخ سفت، بند و ناف (Heydari Sharif Abad & Torknejad, 2000). میزان خواب و جوانه­زنی بذر تحت تأثیر عامل­های متعددی از جمله: تعداد لایه­های تستا و نوع اپیدرم، فرابر میوه، موقعیت دانه بر روی گیاه، اندازه و وزن دانه، سن گیاه، طول روز، زمان برداشت و ... تغییر می­کند (Castro, Lammeren, Groot, Bino, & Hilhorst, 2000; Debeaujion & Koornneef, 2000; Debeaujion, Leon – kloosterziel, & .M, 2000).

از موادی­که برای از بین­بردن سختی بذر در یونجه­های یک­ساله به­کار برده می­شود، می­توان به نیترات پتاسیم و اسید سولفوریک اشاره نـمود که باعث افزایش درصد جـوانه­زنی بـذرهای یونجه یک­ساله می­گردند (Taiz & Zeiger, 1998). وقتی بذور خارج شده از غلاف یونجه یک­ساله با اسید سولفوریک شستشو داده می­شوند، اثری که روی بذر می­گذارد این است که سبب حل شدن و از بین رفتن لایه ژلاتینی موجود بر روی بذر می­گردد، در نتیجه بذر قادر به جذب آب و به دنبال آن جوانه­زنی خواهد شد. البته در این زمینه باید توجه کافی مبذول گردد که نرمالیته اسید سولفوریک و مدت زمان شستشو با اسید مناسب باشد، زیرا اگر به این دو مسئله توجه کافی نشود اسید سولفوریک سبب حل شدن و از بین رفتن بخش­هایی از بذر شده و در نتیجه بذر قابلیت حیات خود را از دست می­دهد (Radwan, Brahim, Mohamed, & Fakhry 1980).

در گیاهان مرتعی به­ویژه در یونجه­های یک­ساله، عامل­های تنظیم­کننده جوانه­زنی نقش بسیار مهمی در بقای گونه ایفا می­نمایند؛ ولی در زمان عملیات اصلاح نباتات و نیز آزمون­های بذری و درنتیجه نیاز به جوانه­زنی سریع، این پدیده می­تواند محدودیت­هایی را ایجاد نماید
 (Mirzaei Nedoushan, 2001). در بعضی موارد سختی بذر یکی از مزیت­های مثبت یونجه­های یک­ساله قلمداد می­شود؛ چـرا که با این ویژگی، این گونه­ها به­راحتی می­توانند در محیط­های خشک و دارای بارندگی نامنظم دوام بیاورند؛ و بدون بذرکاری مجدد، سال­های متمادی خودبه­خود تکثیر شده و تراکم مناسبی از علوفه نیز در عرصه ایجاد نمایند. از این­رو گونه­ها و رقم­هائی که شکستن سختی بذر در آن­ها به­کندی انجام می­شود، ممکن است قادر باشند که زمان طولانی­تری را در خاک دوام آورده و دوره­های خشکی متعددی را با موفقیت سپری نمایند
 (Mirzaei Nedoushan, 2001). میزان جوانه­زنی و قدرت گیاه­چه[1] یونجه­های­ یک­ساله تا حد زیادی تحت تأثیر شرایط محیطی قرار دارد که بذر در آن پرورش یافته است؛ به­گونه­ای­که در جنوب استرالیا هنگامی که غلاف گونه­های مختلف، پس از خشک شدن روی زمین می­ریزند برای مدت زیادی رطوبت جذب می­کنند؛ و نسبت به آن­هایی که در اعماق بیش­تر خاک قرار دارند، زودتر شروع به جوانه­زنی می­نمایند (Williams, 1980).

با توجه به اهمیت یونجه­های یک­ساله به­عنوان یکی از اجزای کشاورزی پایدار[2] و وجود سختی بذر در بیش از 90 درصد از آن­ها (Azizi et al., 2006) ، ضرورت انجام مطالعه و تحقیق در این زمینه احساس گردید؛ و با اجرای این پژوهش در خرم­آباد، تأثیر اسید سولفوریک، دما و منشأ بذر بر شکست سختی بذر یونجه یک­ساله  مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش­ها

این تحقیق در سال زراعی 85 – 1384 در دانشکده کشاورزی دانشگاه لرستان واقع درکیلومتر 12 جاده خرم­آباد- اندیمشک اجرا گردید. خاک مورد استفاده دارای دو نوع بافت سیلتی­رسی و شنی بود. تحقیق به­صورت دو آزمایش اسپلیت – فاکتوریل در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی با 16 تیمار در چهار تکرار طراحی و انجام شد. عامل­های مورد مطالعه عبارت بودند از: 1– تیمار های اسید (بذور شستشو داده شده با اسید سولفوریک و بذور بدون شستشو با اسید سولفوریک). 2- تیمارهای منشأ بذر (خرم­آباد و کرج) و 3- تیمارهای دمایی (پنج، 15، 30، 45 درجه سانتی­گراد).

تعین مناسب­ترین نرمال اسید سولفوریک و مدت زمان مناسب برای شستشو

قبل از آزمایش اصلی ابتدا باید مناسب­ترین نرمال اسید سولفوریک و زمان شستشو تعیین
 می­شد. برای تعیین مناسب­ترین نرمال اسید سولفوریک و مدت زمان فرو بردن بذرها در اسید یک آزمایش مقدماتی صورت گرفت که در آن سه نوع نرمال مختلف اسید شامل 1 نرمال ، 5/1  نرمال و 10/1 نرمال را در پنج زمان متفاوت 1 ، 5 ، 10 ، 15و 20  ثانیه برای هر دو توده بذرهای پرورش یافته در خرم­آباد و کرج، به صورت آزمایش فاکتوریل بر پایه بلوک­های کاملا تصادفی و در سه تکرار اجرا گردید و بهترین نتیجه برای آزمایش اصلی مورد استفاده قرار گرفت. مناسب­ترین نرمـال اسـید سولـفوریک و مـدت زمان فرو بردن بذر در اسـید سولفوریک برای بذر  خرم­آباد 10/1 نرمال و مدت زمان یک ثانیه و برای بذر کرج 10/1 نرمال و مدت زمان 5 ثانیه تعیین شد.

تعیین سختی بذر اولیه

برای انـداره­گیری درصد سـختی بذر اولیه، تـعداد 100 عدد بذر از بذرهای پرورش­یافته در کرج و خرم­آباد انتخاب گردید؛ و در بستر مناسب بر روی حوله کاغذی در داخل بشقابک کشت و در داخل ژرمیناتور با دمای 20 درجه سانتی­گراد قرار گرفت. بعد از 10 روز تعداد بذرهای جوانه­زده شمارش و بذرهایی که هیچ­گونه آبی جذب نکرده و هم­چنان بدون جوانه­زدن باقی مانده بودند، در شمار بذرهای سخت اولیه محسوب شدند. بدین­وسیله درصد سختی بذر اولیه محاسبه شد که برای هر دو توده بذر پرورش­یافته در خرم­آباد و کرج، 90 درصد تعیین گردید.

در آزمایشگاه بخشی از بذور پرورش یافته در خرم­آباد و کرج را پس از فرو بردن در اسید سولفوریک (برای بذور با مننشأ خرم­آباد یک ثانیه و برای بذور با منشأ کرج پنج ثانیه) با آب مقطر شستشو داده و پس از ایـن­که با کاغذ صـافی خـشک شدند، در پتری دیش­های 15 سانتی­متری که در کف پتری دیش­ها دو لایه کاغذ صافی قرار داده شده بود، گذاشته شدند. در هر پتری دیش 100 عدد بذر قرار داده شد. سپس پتری دیش­ها در انکوباتور در دماهای مورد نظر (5 ، 15 ،30 ، 45 درجه سانتی­گراد) قرار داده شدند. بخش دیگری از بذرهای پرورش یافته در خرم­آباد و کرج را بدون اینکه با اسید سولفوریک شسته شوند، مانند مراحل بالا در پتری­دیش­های 15 سانتی­متری گذاشته و در دماهای مورد نظر (5 ، 15 ،30 ، 45  درجه سانتی­گراد) در درون انکوباتور قرار داده شدند. مدت زمانی که بذر­ها در هر دما در انکوباتور نگهداری شدند یک ماه بود. پس از اتمام مدت زمان تعیین شده بذرها در دمای 25 – 20 درجه سانتی­گراد و رطوبت کافی قرار داده شدند تا جوانه بزنند .

به منظور جلوگیری از اثرات نا مطلوب آللوپاتیک بذرها بر روی جوانه­زنی یکدیگر، در موقع جوانه­زنی، فاصله بذرها سه برابر قطرشان در نظر گرفته شد. پس از ده روز تعداد بذرهای جوانه زده شمارش و طول ریشه­چه اندازه­گیری گردید. تجزیه واریانس کلیه صفات مورد بررسی به وسیله  نرم افزار SAS انجام گرفت. میانگین صفت­های مزبور، با آزمون چنددامنه­ای دانکن در سطح 1 و 5 درصد مقایسه گردیدند؛ و نمودارها با استفاده از نرم­افزار EXCEL طراحی و رسم شدند.

نتایج و بحث

اثر دما، اسید سولفوریک و منشا بذر بر روند شکست سختی بذر یونجه یک­ساله
 Medicago scutellata cv. Robinson

در تجزیه واریانس داده­ها اثر متقابل دما، اسید سولفوریک و منشأ بذر بر درصد جوانه­زنی اختلاف معنی­داری مشـاهده نشد (جدول 1)، اما در مقایـسه میـانگین­ها در آزمـون دانـکن اختلاف معنی­داری در سطح 5 درصد مشاهده شد. بیشترین درصد جوانه­زنی مربوط به تیمار شستشو داده شده با اسید سولفوریک، دمای 15 درجه سانتی­گراد و منشأ بذر خرم­آباد برابر 75/50 درصد می­باشد. هر چند که با دو تیمار شستشو داده شده با اسید سولفوریک، دمای 5 درجه سانتی­گراد و منشأ بذر خرم­آباد و تیمار شستشو داده شده با اسید سولفوریک، دمای 30 درجه سانتی­گراد و منشأ بذر خرم­آباد به ترتیب معادل 50/48 و 48 درصد در یک گروه می­باشند و کمترین درصد جوانه­زنی مربوط به تیمار بدون شستشو با اسید سولفوریک، دمای 45 درجه سانتی­گراد و منشأ بذر کرج معادل 75/23 می­باشد (شکل 1) .

میانگین دماهای مختلف بر درصد جوانه­زنی نشان می­دهد که با افزایش دما (45 درجه سانتی­گراد) درصد جوانه­زنی کاهش می­یابد ولی سایر دماهای مورد آزمایش (5 ، 15 و 30 درجه سانتی­گراد) در یک گروه قرار گرفته­اند (بجز درمورد تیمار بدون شستشو و منشا بذر کرج). پس دلیل کاهش درصد جوانه­زنی بذور در دمای 45 درجه سانتی­گراد را می­توان به تجزیه مواد اندوخته­ای بذر و مصرف انرژی تولید شده از آن در طی فرایند تنفس نسبت داد، در نتیجه بذر قادر به تامین انرژی لازم برای جوانه­زنی نخواهد بود و یا بر اثر فعل و انفعالات شیمیایی قابلیت حیات خود را از دست می­دهد (Zheng–xing, parrish, & Welbaum, 2001). همچنین شرایط محیطی در طول دوره رشد بذور پرورش یافته در کرج نسبت به بذور پرورش یافته در خرم آباد، برای تشکیل لایه ژلاتینی (عامل اصلی سختی پوسته بذر) مناسب­تر بوده و در نتیجه سختی بذر نیز افزایش یافته و به تبع درصد جوانه­زنی آن نیز کمتر شده است.

دمای بالا (45 درجه سانتیگراد) در مورد هر دو گروه بذور کرج و خرم­آباد باعث کاهش درصد جوانه­زنی بذر شد و هر دو منشاء بذر در این دما در یک گروه قرار گرفتند. از نتایج مهم دراین آزمایش می­توان به این موضوع اشاره داشت که در هر دمای مورد آزمایش، بذور با منشأ خرم­آباد درصد جوانه­زنی بذر بیشتری نسبت به بذور با منشأ کرج داشتند. به­عبارتی شرایط اقلیمی خرم­آباد به نحوی در تشکیل پوسته بذر اثر گذاشته است که سختی بذر آن بیشتر کاهش می­یابد.

شستشوی بذور با اسید سولفوریک باعث افزایش درصد جوانه­زنی بذر می­گردد (Radwan, et al., 1980) در حین تشکیل بذر در یونجه­های یکساله، یک پوسته چوب پنبه­ای در اطراف بذر تشکیل می­شود و زمانی که رطوبت بذر به 8 درصد می­رسد رشد این پوسته تکمیل می­گردد. همچنین یک لایه ژلاتینی بر روی بذر یونجه یک­ساله قرار دارد که مانع جوانه­زنی آن می­شود و فقط زمانی اجازه جوانه­زنی به بذر را می­دهد که بر اثر بارندگی مناسب و کافی این لایه شسته شود (Bewley & Black, 1994).

وقتی بذور بدون غلاف یونجه یکساله با اسید سولفوریک شستشو داده می­شوند سبب حل شدن و از بین رفتن لایه ژلاتینی موجود بر روی بذر می­شود در نتیجه بذر قادر به جذب آب و به دنبال آن جوانه­زنی خواهد شد. البته در این زمینه باید دقت کافی مبذول گردد که نرمال اسید سولفوریک و مدت زمان شستشو با اسید مناسب باشد، زیرا اگر به این دو مسئله توجه کافی نشود اسید سولفوریک سبب حل شدن و از بین رفتن بخش­هایی از بذر شده و در نتیجه بذر قابلیت جوانه­زنی یا قابلیت حیات خود را از دست می­دهد (Zheng–xing, et al., 2001). تحقیقات نشان داده که شستشوی بذور یونجه­های یک­ساله با اسیدسولفوریک سبب کاهش سختی بذر و افزایش درصد جوانه­زنی بذر می­گردد. که با نتایج این تحقیق مطابقت دارد (Radwan, et al., 1980; Taiz & Zeiger, 1998).

 از آن­جا که درصد جوانه­زنی در هر دو تیمار شستشو با اسید سولفوریک و عدم شستشو در بذور پرورش یافته درخرم­آباد بیشتر از بذور پرورش یافته در کرج می­باشد. و با ذکر این موضوع که در آزمایش مقدماتی که برای تعیین مناسب­ترین نرمالیته اسید سولفوریک و مدت زمان قرار گرفتن بذر در اسید انجام شد، بهترین نتیجه برای بذور پرورش یافته در خرم آباد 10/1  نرمال و مدت زمان یک ثانیه و برای بذور پرورش یافته در کرج 10/1  نرمال و مدت زمان پنج  ثانیه بدست آمد، علی­رغم اینکه مدت زمان قرار گرفتن بذر در اسید سولفوریک در بذور کرج بیشتر از بذور خرم­آباد بود اما با این وجود هنوز هم سختی بذر بذور کرج بیشتر از بذور خرم­آباد می­باشد.

اثر دماهای مختلف، اسید سولفوریک و منشا بذر بر طول ریشه­چهبذور جوانه زده یونجه یک­ساله
 Medicago scutellata cv . Robinson

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بین اثرات متقابل دما، اسید سولفـوریک و منشأ بذر بر طول ریشه­چه اختلاف معنی­داری وجود ندارد (جدول 1)، اما در مقایسه میانگین­ها در آزمون دانکن اختلاف معنی­داری در سطح پنج درصـد مشـاهده شــــــد. تیمار دمایی 5 درجه سانتی­گراد در هر روش شستشو و منشأ بذر دارای بالاترین طول ریشه­چه بود. کمترین طول ریشه­چه معادل 9/2 سانتی­متر مربوط به تیمار بدون شستشو با اسید سولفوریک، دمای 45 درجه سانتی­گراد، منشأ بذر خرم­آباد بود هر چند که با تیمار شستشو با اسید سولفوریک، دمای 45 درجه سانتی­گراد، منشاء بذر کرج، تیمار شستشو با اسید سولفوریک، دمای 45 درجه سانتی­گراد، منشأ بذر خرم­آباد و تیمار بدون شستشو با اسید سولفوریک، دمای 45 درجه سانتی­گراد، منشأ بذر کرج به ترتیب معادل 7/3 ، 2/3 و 3 سانتی­متر در یک گروه بود (شکل 2) .  

Medicago scutellata cv. Robinso

Azizi و همکاران (2004) نشان دادند که دما بر روی طول ریشه­چه و میزان گره بندی و تثبیت نیتروژن یونجه­های یک­ساله اثر می­گذارد، به­عبارتی هوای خنک طول ریشه­چه، گره­بندی و تثبیت نیتروژن را افزایش می­دهد. البته میزان این تأثیر در گونه­های مختلف یونجه یک­ساله متفاوت می­باشد، این نتایج با نتایج این تحقیق مطابقت دارد (Azizi, Amini Dehaghi, & Abbasipour, 2004).

بذر در حقیقت گیاهچه­ای زنده و در حال رشد است و بسیاری از فرایندهای حیاتی از جمله تنفس در آن صورت می­گیرد. شدت تنفس نه­تنها تحت­تأثیر عوامل درونی بذر می­باشد، بلکه به­شدت از مجموعه عوامل بیرونی نظیر رطوبت نسبی و دما تأثیر می­پذیرد (Hejazi, 1994). هر چه رطوبت نسبی و دمای محیطی که بذر در آن قرار دارد بیشتر باشد، شدت و سرعت تنفس نیز بیشتر می­شود. دمای بالا علاوه­بر این­که باعث فعال شدن تعدادی از واکنش­های آنزیمی و متابولیکی و در نتیجه زوال سریع بذر می­شود، بلکه باعث مصرف و کاهش مواد اندوخته­ای بذر شده در نتیجه  میزان انرژی و مواد دردسترس جنین بذر کاهش یافته و به تبع تقسیم سلولی و سرعت رشد کم و نهایتاً طول ریشه­چه و سایر اندام­های منشأ گرفته از بذر کاهش می­یابد (Hejazi, 1994). بنابراین می­توان گفت که بین طول ریشه­چه و افزایش دما رابطه عکس وجود دارد، البته این مطلب در محدوده دمایی بالا (45 درجه سانتی­گراد) صدق نمی­کـند. به­عــبارتی با افزایـش دما ( بالاتر از 45 درجه سانـتی­گراد)  طول ریشـه­چه کاهش می­یابد (Wagner & Spira, 1994).

شستشوی بذر یونجه­های یک­ساله با اسید سولفوریک سبب کاهش سختی بذر آن­ها و افزایش درصد جوانه­زنی بذر می­گردد (محمود زاده و همکاران، 1382). بر اثـر شـستشوی بـذر با اسید سولفوریـک ضـخامت پوسـته کمـتر ونفوذپذیری آن نسبت به آب وهوا بیشتر می­شود. در نتیجه بذر انرژی کمتری را صرف خارج نمودن ریشه­چه و ساقه­چه از پوسته کرده و به تبع آن می­تواند این انرژی را صرف رشد بیشتر ریشه­چه و سایر اندام­های گیاه­چه نماید (Wagner & Spira, 1994).

بذور یونجه یک­ساله پرورش یافته در خرم­آباد و کرج که در این آزمایش مورد استفاده قرار گرفتند، هر دو در شرایط آبی کشت شده بودند. از آنجا که درصد جوانه­زنی و شکست سختی بذر در بذور پرورش یافته در خرم­آباد بیشتر است پس می­توان اینگونه نتیجه­گیری کرد که شرایط محیطی اعم از حرارت در طول دوره رشد یونجه یک­ساله پرورش یافته در کرج برای گیاه مطلوب­تر بوده است و در نتیجه سختی بذر آن بهتر شکل گرفته و به تبع کمتر شکسته شده است.

نتیجه­گیری:

1-  شستشوی بذر یونجه یک­ساله با اسید سولفوریک سبب شکست سختی بذر آن می­گردد.

2-  نگهداری بذور در دماهای بالا (45 درجه سانتی­گراد) قبل از جوانه­زنی موجب کاهش تعداد بذور جوانه­زده به هنگام جوانه­زنی می­شود و اکثر بذور قابلیت جوانه­زنی یا قابلیت حیات خود را از دست می­دهند و جوانه­زنی را به شدت کاهش می­دهند.

3- طول ریشه­چه تحت­تأثیر دمایی که بذر قبل از جوانه­زنی در آن قرار داشته قرار می­گیرد. هر چه دما بیشتر بوده باشد طول ریشه­چه به هنگام جوانه­زنی کمتر می­شود که آن را می­توان به میزان و شدت  فعالیت­ها و تغییرات درون بذر از جمله تنفس نسبت داد.

4- شرایط محیطی (دما، بارندگی، نور و ...) که بذر در آن پرورش یافته است بر روی میزان سختی بذر یونجه یک­ساله اثر می­گذارد. به­نحوی­که هر چه این شرایط برای گیاه در طول دوره رشد مساعدتر باشند، سختی بذر بیشتر شده و به تبع شکست سختی بذر درآن کمتر و کندتر می­شود.

جدول 1- خلاصه جدول تجزیه واریانس مربوط به تأثیر دماهای مختلف، اسید سولفوریک و منشأ بذر بر روی درصد جوانه­زنی و طول ریشه­چه یونجه یک­سالهMedicago scutellata cv Robinson

^*، ^ns و ^** به­ترتیب: معنی­دار، غیرمعنی­دار و خیلی­معنی­دار